復合芽孢桿菌對鯽魚養(yǎng)殖水體水質(zhì)及細菌群落結構的影響

李 雪，劉述鳳，鄢雨朦，張潤潔，王天杰，付保榮

(遼寧大學環(huán)境學院，遼寧沈陽 110036)

我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，2017年全國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量達4 792萬t，占世界總產(chǎn)量的60%以上［1］。但高密度集約化養(yǎng)殖使得養(yǎng)殖水體營養(yǎng)鹽N、P等濃度超標，容易引發(fā)魚蝦類傳染性疾病，破壞養(yǎng)殖水體及周遭環(huán)境［2］。近年來，約40%的傳統(tǒng)水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域被劃入生態(tài)紅線范圍，尋找經(jīng)濟高效且無毒害的水質(zhì)改良工藝成為研究的熱點。

目前，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖水體水質(zhì)調(diào)控的物理化學方法主要包括增氧、換水、吸附、氧化還原法等，這些方法存在處理效果差、成本高、產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物等缺陷［3-4］。利用生物自身代謝對養(yǎng)殖水體進行調(diào)控的生物方法主要包括引進水生植物、配養(yǎng)生態(tài)互補型水生動物、投加微生態(tài)制劑等。利用水生植物、水生動物調(diào)控具有一定風險性，易引起物種入侵，危及生態(tài)平衡。而微生態(tài)制劑具有改善水質(zhì)、防治病害、無殘留、成本低、安全性好等優(yōu)勢，被廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖［5］，并能有效減少水產(chǎn)養(yǎng)殖對抗生素的依賴［6-7］。且光合細菌［8］、硝化細菌［9］、反硝化菌［10］及芽孢桿菌［11-12］等在水產(chǎn)養(yǎng)殖水環(huán)境中改善效果較好。然而隨著養(yǎng)殖水體污染因子趨于復雜化，單一菌種在脫氮除磷等方面存在一定局限性。利用各菌種之間的相互作用是目前為止水體凈化較有效的方法。目前國內(nèi)外將2種或2種以上具有特定作用的單一菌種做成復合制劑投加于養(yǎng)殖水體中，能形成發(fā)揮多種功能且穩(wěn)定的微生物群體［13］。宋協(xié)法等［14］研究表明混合菌處理養(yǎng)殖污水的能力優(yōu)于單菌種。

水體中微生物在營養(yǎng)元素循環(huán)、去除污染物、分解有機物、抑制病原菌等方面起著重要作用［15-17］，并且微生物群落結構變化能影響?zhàn)B殖水體水質(zhì)及養(yǎng)殖生物的健康狀況。因此，研究投加外源微生態(tài)制劑對養(yǎng)殖水體微生物群落結構的影響能從微觀層面揭示微生物凈化水質(zhì)機理，提高水質(zhì)凈化效率［18］。但目前有關微生態(tài)制劑對鯽魚(Carassius aumtus)養(yǎng)殖水體微生物群落結構影響的研究仍鮮見報道。筆者以鯽魚為研究對象，研究復合芽孢桿菌對養(yǎng)殖水體營養(yǎng)鹽(N、P)的改善情況，并利用16SrDNA高通量技術，分析投加菌種后養(yǎng)殖水體微生物群落結構的變化，探索其中對污染物降解起重要作用的功能性微生物，以期揭示微生態(tài)制劑的作用機理及微生物群落的動態(tài)演變規(guī)律，為微生態(tài)制劑改善養(yǎng)殖水體水質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis，簡稱BS)和凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans，簡稱BC)購自遼寧華星生物科技有限公司，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium，簡稱A0)由實驗室分離純化得到，保藏號為CCTCC 13452。經(jīng)培養(yǎng)稀釋，菌液的活菌量為2.0×108cfu·mL-1。

1.2 試驗設計及飼養(yǎng)管理

試驗用鯽魚、用水和底泥均取自沈陽某養(yǎng)殖池塘。水體水質(zhì)參數(shù):pH值為7.2，ρ(溶解氧)為7.65 mg·L-1，ρ(氨氮)為 1.34 mg·L-1，ρ(硝態(tài)氮)為0.18 mg·L-1，ρ(亞硝態(tài)氮)為 0.41 mg·L-1，ρ(總磷)為 0.204 mg·L-1。

選取質(zhì)量為(60±3)g的健康鯽魚180尾，隨機分為對照組(CK)、復合芽孢桿菌A0+BS組(A0+BS)、復合芽孢桿菌A0+BC組(A0+BC)，每組3個重復，每個重復20尾魚，在規(guī)格為100 cm×50 cm×60 cm的水族箱中進行室外試驗。每個水族箱加180 L養(yǎng)殖水，水底加入10 cm厚底泥，氧氣泵加氧控制水體溶解氧。試驗期間水溫為14～24℃，隨環(huán)境溫度變化，pH值為7.1～7.4。每天投喂2次餌料。

試驗開始時，CK組添加540 mL無菌水，A0+BS組投加A0菌液、BS菌液各270 mL，A0+BC組投加A0菌液、BC菌液各270 mL。由于此種復合菌作用效果可以持續(xù)15 d左右，故時間設計為15 d，以探究復合菌作用期間各指標的變化。

1.3 試驗方法

1.3.1 水質(zhì)分析方法

每隔2 d取水樣500 mL，經(jīng)過濾后測定各水樣的水質(zhì)指標。采用水楊酸分光光度法(HJ/T 536—2009)測NH4+-N濃度，N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法(F-HZ-HJ-SZ-0031)測NO2--N濃度，紫外分光光度法(HJ/T 346—2007)測 NO3--N濃度，鉬酸銨分光光度法(GB 1894—1989)測TP濃度［19］。

采用Origin 8.0和SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。

1.3.2 DNA提取

經(jīng)0.22 μm孔徑聚碳酸酯膜負壓抽濾，用滅菌的剪刀將濾膜剪碎，置于2 mL無菌離心管中，利用Soil DNA kit(OMEGA)試劑盒提取細菌總DNA。

1.3.3 高通量測序

對各樣本環(huán)境基因組DNA中細菌16SrRNA V3-V4區(qū)進行擴增:引物為 341F(5"-CCTACGGGNGGCWGCAG-3")和805R(5"-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3")。PCR反應條件為94 ℃ 3 min、94 ℃ 30 s、45 ℃ 20 s、65 ℃ 30 s，5 個循環(huán);94 ℃ 20 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s，20個循環(huán);72℃ 5 min。PCR結束后，使用w=2%瓊脂糖對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測。將各樣品的PCR產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司在Illumina-Miseq平臺上進行高通量測序。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

為保證信息分析質(zhì)量，使用Cutadapt 1.2.1軟件去除引物接頭;使用Pear 0.9.6軟件進行序列拼接;使用Prinseq 0.20.4軟件進行序列過濾;使用Mothur 1.30.1軟件去除嵌合體序列，最后獲得用于分析的優(yōu)質(zhì)系列。將相似性為97%的序列分成不同的操作分類單元(OTU)，采用QIIME 1.8.0軟件對OTU進行Alpha多樣性分析，包括Shannon指數(shù)(Ishannon)、Simpson指數(shù)(Isimpson)、Chao指數(shù)(Ichao)和ACE指數(shù)(IACE)，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似度水平的OTU代表序列進行分類學分析，統(tǒng)計各樣品門、屬水平的群落組成。各指數(shù)計算方法如下:

式(1)～(7)中，Ichao為估計群落中含OTU數(shù)目的指數(shù);Sobs為實際OTU數(shù)目;n1為只含1條OUT數(shù)目;n2為只含2條OUT數(shù)目;EAC為估計群落中OTU數(shù)目的指數(shù);Sabund為多于abund條序列的OTU數(shù)目，其中abund為優(yōu)勢OTU的閾值，默認為10;Srare為含有abund條序列或者少于abund的OTU數(shù)目;為稀有物種變異系數(shù)的估算值;CEAC為各樣品文庫的覆蓋率;Nrare為第i個OTU包含序列數(shù)與i乘積的累加和;Ishannon估算樣品中微生物Shannon多樣性指數(shù);Isimpson為估算樣品中微生物Simpson多樣性指數(shù);ni為第i個 OTU包含序列數(shù);N為總OTU數(shù)。

2 結果與分析

2.1 復合芽孢桿菌對養(yǎng)殖水體N、P濃度的影響

前11 d各組NO2--N 濃度基本保持不變，隨后A0+BS和A0+BC組NO2--N濃度下降，A0+BS組下降速率快于A0+BC組，試驗結束時分別降低了76.3%和65.8%，與CK差異顯著(P＜0.05)。前5 d CK組NO3--N濃度基本不變，5 d后急劇上升，9 d后趨于平緩;處理組7 d后NO3--N濃度不斷上升。各處理組NO3--N濃度始終低于CK組，第9天處理組與 CK組差異最大，A0+BS、A0+BC和 CK組ρ(NO3--N)分別為 0.29、0.34 和 0.45 mg·L-1，A0+BS的處理效果優(yōu)于A0+BC組。試驗期間各組TP濃度整體先上升后下降，且前11 d A0+BC組TP濃度顯著高于CK組(P＜0.05)，A0+BS組TP濃度顯著低于CK組(P＜0.05)，第13天A0+BS組 TP濃度最低，與CK相比降低了80.3%。

2.2 復合芽孢桿菌對養(yǎng)殖水體微生物群落結構的影響

2.2.1 微生物群落多樣性分析

如表1所示，統(tǒng)計3個組CK、A0+BC、A0+BS包含的OTU 數(shù)目分別為8 639、7 558、7 761，CK 組與A0+BC組、AO+BS組具有顯著性差異(P＜0.05)。CK組與A0+BS組Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)具有顯著性差異(P＜0.05)，且A0+BS組生物多樣性最高。CK組與A0+BC組Chao指數(shù)和Ace指數(shù)具有顯著性差異(P＜0.05)，且CK組物種總數(shù)最高。

Shannon稀釋曲線可用來比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，也可用來說明樣本測序數(shù)據(jù)量是否合理。如圖2所示，當在0.97相似性水平下曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。從圖中可看出相同序列數(shù)時A0+BS組的指數(shù)最大，群落多樣性最高。

圖1 養(yǎng)殖水體營養(yǎng)鹽N、P濃度的變化Fig.1 Changes of N and P concentrations in culture water

表1 細菌群落豐富度和多樣性指數(shù)Table 1 Bacterial community richness and diversity index

圖2 Shannon指數(shù)稀釋曲線Fig.2 Shannon index dilution curve

2.2.2 微生物群落組成

如圖3所示，CK組在門分類水平上微生物群落結構具有較高的多樣性，優(yōu)勢菌主要為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和綠彎菌門(Chloroflexi)等，其所占比例分別達57.8%、25.3%、8.2%和3.7%;A0+BC和A0+BS組優(yōu)勢菌組成基本相同，變形菌門分別占90.4%和89.1%，擬桿菌門分別占5.7%和4.8%，放線細菌門(Actintobacteria)分別占2.2%和3.9%，其中變形菌門所占比例均最大。

如圖4所示，3組水樣中細菌覆蓋了85個屬，其中36個屬相對豐度大于1%。CK組優(yōu)勢菌主要為賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、土壤芽孢桿菌屬(Solibacillus)、血液桿菌屬(Haematobacter)、弓形桿菌屬(Arcobacter)、狹義梭菌屬(Clostridium sensustricto)等，其中賴氨酸芽孢桿菌屬和土壤芽孢桿菌屬占比最大，分別為27.6%和9.5%;A0+BC組優(yōu)勢菌主要為叢毛單胞菌屬(Comamonasin)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、未分類菌、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)，其中叢毛單胞菌屬、不動桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬占比最大，分別為27%、14%和9.5%。A0+BS組優(yōu)勢菌主要為叢毛單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、柄桿菌屬(Caulobacter)、嗜酸菌屬(Acidovorax)、假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、硝化桿菌屬(Bosea)、Dokdonella屬、黃色單胞菌屬(Thermomonas)等，其中叢毛單胞菌屬和柄桿菌屬占比最大，分別達8.1%和8.0%。

圖3 3個水樣門水平微生物群落結構組成分布Fig.3 Distribution of microbial community structure in three water samples

圖4 3個水樣屬水平微生物群落結構組成分布Fig.4 Distribution of microbial community structure in three water samples

在屬分類水平上，對3組水樣相對豐度大于3%的優(yōu)勢菌進行方差分析(圖5)。3組水樣包括14個優(yōu)勢菌屬，且均具有顯著性差異(P＜0.05)，與A0+BC、A0+BS組相比，CK組優(yōu)勢菌賴氨酸芽孢桿菌屬 (Lysinibacillus)、土壤芽孢桿菌屬(Solibacillus)、狹義梭菌屬(Clostridium sensustricto)、血液桿菌屬(Haematobacter)有顯著差異(P＜0.05);與CK、A0+BS組相比，A0+BC組優(yōu)勢菌叢毛單胞菌屬(Comamonasin)、不動桿菌屬(Acinetobacter)有顯著差異(P＜0.05);與CK、A0+BC組相比，A0+BS組優(yōu)勢菌柄桿菌屬(Caulobacter)、嗜酸菌屬(Acidovorax)、Dokdonella屬有顯著差異(P＜0.05);A0+BC與A0+BS組之間寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、硝化桿菌屬(Bosea)無顯著差異。

圖5 屬水平上優(yōu)勢菌相對豐度的差異性分析Fig.5 Difference analysis of relative abundance of dominant bacteria at the genus-level

3 討論

3.1 復合芽孢桿菌的脫氮除磷作用

研究表明，微生態(tài)制劑能夠分解和利用養(yǎng)殖水體中的殘餌、排泄物，通過氧化、氨化、硝化、除磷、固氮等作用，降低水體中NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TP濃度，抑制致病菌和有害菌［20］。常見的微生態(tài)制劑芽孢桿菌屬好氣性細菌，可以改善水質(zhì)，促進水體的氮循環(huán)，降低NH4+-N、NO2--N等有害物質(zhì)濃度，維持水生態(tài)平衡［21］。

鯽魚排泄物及殘余餌料經(jīng)微生物分解，變成NH4+-N 等小分子無機物［22］，導致 NH4+-N濃度上升。當魚體內(nèi)NH4+-N含量超標時，會表現(xiàn)出致死效應［23］。試驗前期，各組養(yǎng)殖水體中NH4+-N濃度逐漸升高，且處理組低于CK組，說明短時間內(nèi)由于復合芽孢桿菌繁殖量少，微生物對殘留餌料及鯽魚排泄物分解產(chǎn)生的NH4+-N量超出了復合芽孢桿菌的降解能力，但2種復合芽孢桿菌對NH4+-N均有一定降解作用。5 d后由于復合芽孢桿菌增殖產(chǎn)生的胞外酶能把養(yǎng)殖水體中的有機質(zhì)分解，引起處理組NH4+-N濃度下降，且復合芽孢桿菌A0+BS對NH4+-N的去除效果最佳。與試驗周期為16 d的大薸-微生態(tài)制劑協(xié)同凈化養(yǎng)殖水體NH4+-N變化情況一致［24］。NO2--N是NH4+-N轉(zhuǎn)化成NO3--N的中間產(chǎn)物，對魚類的毒害作用更強。由于復合芽孢桿菌可將NO2--N和NO3--N作為自身氮源進行生長繁殖［25］，使得各處理組 NO2--N濃度均顯著低于CK組，且復合芽孢桿菌A0+BS對NO2--N的降解速率優(yōu)于A0+BC組。張翠綿等［26］將枯草芽孢桿菌與巨大芽孢桿菌組成的復合菌劑投加于養(yǎng)殖池塘，發(fā)現(xiàn)NO2--N的去除效果顯著。NO3--N對養(yǎng)殖生物的毒性比NH4+-N和NO2--N小得多，但是高濃度NO3--N也會對養(yǎng)殖生物的生長產(chǎn)生影響［27］。養(yǎng)殖水體來源于具備硝化功能的菌群對N及的轉(zhuǎn)化。7 d后由于菌群的硝化能力超出了其對的利用率，引起各組NO3--N濃度上升，且處理組低于CK組，說明復合芽孢桿菌可將NO3--N作為氮源利用，與復合芽孢桿菌A0+BC相比，A0+BS對降解效果最優(yōu)。張小平［28］研究發(fā)現(xiàn)在草魚養(yǎng)殖池塘投加枯草芽孢桿菌和施氏假單胞菌混合而成的復合制劑后，一定時間內(nèi)可有效降低養(yǎng)殖水體NO3--N濃度。

高濃度P在養(yǎng)殖水體中極易引起藻類的大量繁殖，造成水體富營養(yǎng)化。趙小蓉等［29］研究發(fā)現(xiàn)細菌在分解磷化合物的同時，一部分P被細菌同化，一部分以無機磷酸鹽狀態(tài)貯藏在細菌細胞內(nèi)。試驗前期養(yǎng)殖水體中的微生物將殘余餌料、代謝廢物分解，釋放出各種形態(tài)的P，引起各組水體TP濃度上升。隨著試驗的進行，微生物大量繁殖，部分P被微生物同化、吸收，引起各組水體TP濃度下降。與CK組相比，A0+BS組對TP降解效果顯著，而A0+BC組TP濃度始終高于CK組，可能由于凝結芽孢桿菌對TP同化吸收能力弱，導致微生物對餌料及代謝廢物分解產(chǎn)生的TP超出復合芽孢桿菌A0+BC的聚磷能力。匡群等［30］發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌對TP具有強降解能力。付天璽［31］指出凝結芽孢桿菌對TP沒有降解效果。邵乃麟等［32］將枯草芽孢桿菌投入鱔蝦稻共作池塘后，TP去除效果顯著。

經(jīng)復合芽孢桿菌A0+BC、A0+BS處理后的養(yǎng)殖水體TP、NH4+-N濃度均低于GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》的Ⅲ級標準〔ρ(TP)≤0.2 mg·L-1，ρ(NH4+-N)≤1 mg·L-1〕，NO2--N和NO3--N濃度均符合 CAMARGO 等［33］和 ZWEIG 等［34］提出的魚蝦安全濃度〔ρ(NO3--N)≤10 mg· L-1，ρ(NO2--N)≤0.15 mg·L-1〕。筆者試驗中，在投加微生態(tài)菌15 d后微生態(tài)菌大部分失活，對N、P營養(yǎng)鹽的降解效果不顯著，但與張小平［28］、王篤彩等［35］為維持養(yǎng)殖水體中一定的活菌數(shù)量，分別每隔7和3 d投加1次菌的研究相比，該微生態(tài)菌作用時間較長。因此，建議在實際養(yǎng)殖水體中，每隔13～15 d投加1次微生態(tài)菌，使養(yǎng)殖水體中N、P營養(yǎng)鹽濃度處于達標狀態(tài)。

3.2 復合芽孢桿菌對微生物群落結構的影響

通過分析3個組的多樣性指數(shù)可知:CK與A0+BS組之間差異顯著，說明在養(yǎng)殖水體投加微生態(tài)菌可以增加微生物群落的多樣性。高多樣性種群有利于提高水生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。鄭佳佳等［36］將復合芽孢桿菌投入到草魚養(yǎng)殖水體后發(fā)現(xiàn)水體菌群多樣性增加。

通過在門、屬分類水平上分析3個水樣微生物群落發(fā)現(xiàn)，投加外源菌可改變原有群落內(nèi)部種群之間的競爭關系，導致優(yōu)勢種群的變更或產(chǎn)生部分對營養(yǎng)鹽有抗性的微生物。復合芽孢桿菌可以快速改善水體中N或P，從而引發(fā)水體中微生態(tài)環(huán)境的變化，導致微生物群落結構的變化。陳琛等［37］研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門、放線細菌門和擬桿菌門在凡納濱對蝦高位池養(yǎng)殖水體中豐度最高;ZHANG等［38］研究發(fā)現(xiàn)，在凡納濱對蝦淡水養(yǎng)殖水體中變形菌門、藍細菌門、放線細菌門和擬桿菌門是水體微生物的主要類群。該研究A0+BS、A0+BC組變形菌門相對豐度增加。A0+BS組放線細菌門相對豐度最高，且A0+BS組硝態(tài)氮和氨氮濃度均低于A0+BC組和CK組。PHILIPPOT等［39］指出硝態(tài)氮和氨氮濃度與放線細菌門豐度呈負相關。另外，放線菌的生長能改善水體，抑制腐敗菌等病原微生物的生長繁殖，轉(zhuǎn)化N、P等元素［40］，與養(yǎng)殖水體N、P去除緊密相關。CK組的擬桿菌門相對豐度高于CK組，可能與CK組氨氮濃度較高有關。JIANG等［41］研究表明擬桿菌門豐度與氨氮濃度呈正相關。

在屬的分類水平上，養(yǎng)殖水體微生物群落比較分散，多樣性高。A0+BS組、A0+BC組的優(yōu)勢菌叢毛單胞菌屬相對豐度最高，為異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌［42］，說明了存在同步硝化反硝化作用。蘇婉昀等［43］指出與傳統(tǒng)脫氨細菌相比，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌在脫氮和去除有機物方面具有較大優(yōu)勢。A0+BC組優(yōu)勢菌不動桿菌屬、假單胞菌屬均為致病菌，危害魚類健康［44］，其相對豐度均顯著高于A0+BS組，說明投加復合芽孢桿菌A0+BS可有效減少致病菌。A0+BS組其他優(yōu)勢菌(硝化桿菌屬、Dokdonella屬)均屬于生物脫氮菌，其中Dokdonella屬是污水處理中常見的脫氮功能菌，具有硝化、反硝化作用［45］。

4 結論

復合芽孢桿菌A0+BS脫氮除磷效果最佳，處理后的養(yǎng)殖水體TP、NH4+-N濃度符合GB 3838—2002的Ⅲ級標準;同時增加了養(yǎng)殖水體微生物群落多樣性，且優(yōu)勢菌大多數(shù)為脫氮功能菌，致病菌減少。表明投加芽孢桿菌可對養(yǎng)殖水體微生物群落結構進行調(diào)控，使養(yǎng)殖水體水質(zhì)得到改善。根據(jù) NY 1109—2006《微生物肥料生物安全通用技術準則》中的菌種安全分級目錄，枯草芽孢桿菌與巨大芽孢桿均屬于免作毒理學試驗的菌種，確保了兩者的安全性，可以直接投加使用。并且復合芽孢桿菌A0+BS在試驗中表現(xiàn)出作用時間較長，無二次污染的優(yōu)點。因此，復合芽孢桿菌A0+BS在養(yǎng)殖水體凈化方面具有潛在應用價值。