基于硫代黃素T誘導(dǎo)G-四聯(lián)體構(gòu)成的生物傳感器檢測鉛離子

夏姣云,徐 彤,卿 靜,熊 艷,劉俊杰,龔福春

(1.長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院,長沙 410114; 2.國家城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)長沙監(jiān)測站,長沙 410009)

鉛是一種具有累積性的有毒元素,是食品和工業(yè)重金屬污染最嚴(yán)重的問題之一[1].重金屬鉛中毒具有持續(xù)性和高度累積性,可不同程度地?fù)p害人體的泌尿系統(tǒng)、 生殖系統(tǒng)、 呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng),嚴(yán)重危害人體健康[2,3].加強對Pb2+的監(jiān)測和控制非常必要,也十分重要.迄今,已有大量關(guān)于Pb2+的檢測方法,如比色法[4]、 光譜法[5,6]和電化學(xué)法[7～12]等.但這些方法存在檢測耗時長、 專業(yè)要求高、 需要大型儀器設(shè)備及高素質(zhì)測試人員等缺點[13].因此,亟需開發(fā)檢測快速、 操作簡便且成本低廉的核酸適體生物傳感器用于檢測鉛離子[14～18].核酸適體是一種通過指數(shù)富集(SELEX)技術(shù)從隨機單鏈核酸序列庫中篩選出的與靶物質(zhì)高度親和的寡核苷酸序列,可以特異性結(jié)合靶分子,具有良好的穩(wěn)定性和選擇性[19,20].含有鳥嘌呤富集(G)重復(fù)結(jié)構(gòu)的G-四聯(lián)體模型可與Pb2+形成G4-Pb2+結(jié)構(gòu)的熒光生物傳感器,用于檢測Pb2+,但這種方法需要進(jìn)行熒光分子標(biāo)記[21～23].本文構(gòu)建了基于硫代黃素T(ThT)熒光分子誘導(dǎo)G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)變化的生物傳感器用于檢測鉛離子(見Scheme 1),無需事先進(jìn)行ThT熒光分子化學(xué)修飾[24,25].ThT是一種市售的水溶性熒光染料,可以特異性地與G-四聯(lián)體結(jié)合[26～32].通常,ThT在自由狀態(tài)下是弱熒光的,當(dāng)溶液中存在G-四聯(lián)體時,ThT會與G-四聯(lián)體結(jié)合導(dǎo)致熒光增加.因此,選用富含G的Pb2+核酸適配體(P1: 5′-AGGTTGGTGTGGTTGGA-3′)作為G-四聯(lián)體.當(dāng)溶液中存在Pb2+時,由于Pb2+和鳥嘌呤堿基之間的高特異性相互作用,最初形成的Pb2+適配體/ThT復(fù)合物被Pb2+適配體/Pb2+復(fù)合物所取代,從而誘導(dǎo)ThT的釋放并伴隨著熒光信號的降低.

Scheme 1 Scheme of the fluorescence Pb2+ aptasensor based on G-quadruplex formation

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

寡核苷酸序列(P1: 5′-AGGTTGGTGTGGTTGGA-3′)由生工生物科技(上海)有限公司通過HPLC合成和純化; 三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自Aladdin試劑公司; Pb(NO3)2,Hg(NO3)2,HNO3,AlCl3,CuCl2,MnCl2,NiCl2,MgCl2,ZnCl2,FeCl2,HCl,NaCl及LiCl均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海); 所用試劑未經(jīng)進(jìn)一步純化直接使用; 超純水由Millipore Milli-Q水純化系統(tǒng)(美國Billerica公司)制備,電阻率>18.25 MΩ·cm.

日本日立公司F-7000型熒光分光光度計,激發(fā)和發(fā)射狹縫分別設(shè)定為5和10 nm,用425 nm的最大激發(fā)波長掃描樣品,掃描范圍460～600 nm; 德國Eppendorf公司ThermoMixer F型恒溫振蕩儀; 美國安捷倫公司7900型電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)儀.

1.2 實驗方法

實驗所用緩沖液均為10 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH=8.3),其中包含2 mmol/L MgCl2[33,34],儲藏于-20 ℃冰箱中.備用的Pb2+,Hg2+和Ag+儲存在0.5%的HNO3溶液中,其它金屬離子儲存在0.5%的HCl溶液中,以防水解.

Pb2+離子的檢測: 在一定量的10 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3,2 mmol/L MgCl2)緩沖液中,加入10 μL 10.0 μmol/L核酸適配體P1,再加入5 μL 1.0 mmol/L ThT熒光分子,然后加入不同濃度的Pb2+溶液,使溶液最終體積為500 μL.將反應(yīng)體系置于孵育器中在室溫下反應(yīng)20 min后,用熒光分光光度計測定熒光值,激發(fā)波長為425 nm,最大發(fā)射波長為500 nm,在460～600 nm波長范圍內(nèi)收集熒光數(shù)據(jù),根據(jù)譜圖分析熒光強度與Pb2+濃度的關(guān)系.

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測Pb2+的可行性

Fig.1 Fluorescence emission spectra of different samples in 10 mmol/L Tris-HCl buffer(pH=8.3) containing 2 mmol/L MgCl2 a. Only 10 μmol/L ThT; b.10 μmol/L ThT+1 μmol/L Pb2+; c.10 μmol/L ThT+100 nmol/L Pb2+aptamer; d.10 μmol/L ThT+100 nmol/L Pb2+ aptamer+1 μmol/L Pb2+; e.buffer.

如圖1所示,當(dāng)10 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3,2 mmol/L MgCl2)緩沖溶液中只有ThT存在時,熒光強度很弱(圖1譜線a); 加入Pb2+后,熒光強度同樣很弱(圖1譜線b); 體系中只有Pb2+適配體和ThT存在時,Pb2+適配體與ThT復(fù)合物的形成使熒光強度增高(圖1譜線c); 加入Pb2+后由于Pb2+適配體與Pb2+的高特異性結(jié)合,使ThT熒光分子被Pb2+取代而進(jìn)入溶液,此時熒光強度明顯降低(圖1譜線d).因此,此方法可以測定溶液中的Pb2+.

2.2 實驗條件的優(yōu)化

實驗中使用10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.3),其中含有濃度為2 mmol/L的Mg2+.在此條件下,優(yōu)化了Pb2+適配體濃度、 ThT熒光分子濃度及反應(yīng)時間3個主要影響因素.首先,優(yōu)化了Pb2+適配體的濃度.由圖2(A)可見,熒光強度降低比值(F0-F)/F(F0和F分別為加入Pb2+前后的熒光值)隨著Pb2+適配體濃度的增加而升高.Pb2+適配體濃度為200 nmol/L時,熒光強度不再顯著增加.因此,本文選擇200 nmol/L作為最佳的Pb2+適配體濃度.其次,優(yōu)化了ThT熒光分子的濃度.圖2(B)顯示熒光強度降低比值(F0-F)/F隨著ThT濃度的增加而升高,并且ThT濃度為10 μmol/L時接近平臺值.因此,實驗選擇10 μmol/L作為最佳的ThT濃度.最后,考察了反應(yīng)時間的影響.圖2(C)示出了檢測波長為500 nm時的熒光強度,可見,反應(yīng)10 min后,熒光強度幾乎無變化,故選擇反應(yīng)時間為10 min.綜上,最佳檢測條件為200 nmol/L Pb2+適配體,10 μmol/L ThT,反應(yīng)時間為10 min.

Fig.2 Optimization of experimental conditions (A) Effect of the concentration of Pb2+ aptamer(10 mmol/L Tris-HCl,pH=8.3,2 mmol/L MgCl2,10 μmol/L ThT+1 μmol/L Pb2+); (B) effect of the concentration of ThT(10 mmol/L Tris-HCl,pH=8.3,2 mmol/L MgCl2,200 nmol/L Pb2+ aptamer); (C) effect of incubation time on fluorescence reduction(10 mmol/L Tris-HCl,pH=8.3,2 mmol/L MgCl2,200 nmol/L Pb2+ aptamer+10 μmol/L ThT+1 μmol/L Pb2+).

2.3 Pb2+傳感器的靈敏度

在最佳實驗條件下,采用濃度分別為0,0.02,0.1,0.5,1,1.5,2.5,5,6,8,10,25,50,100 μmol/L的Pb2+溶液進(jìn)行熒光分析,每個濃度平行測定3次.測定結(jié)果(圖3)表明,隨著溶液中Pb2+濃度的增加,體系的熒光響應(yīng)強度逐漸下降,這歸因于Pb2+適配體/ThT復(fù)合物被Pb2+適配體/Pb2+復(fù)合物所取代,導(dǎo)致ThT被釋放,ThT熒光分子在水溶液中處于自由狀態(tài)時,呈現(xiàn)很弱的熒光.在最大發(fā)射波長500 nm處,Pb2+濃度(20～1000 nmol/L)與對應(yīng)的熒光強度呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)(見圖4),線性方程為Y=-3.196X+1310.486,R2=0.9941.根據(jù)3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(3σ)規(guī)則得出檢出限為1 nmol/L.

Fig.3 Fluorescence emission spectra of ThT in the presence of increasing amounts of Pb2+ c(ThT): 10 μmol/L; c(Pb2+ aptamer): 200 nmol/L.

Fig.4 Fluorescence spectra of the proposed platform at 500 nm vs. Pb2+ concentration Inset: dependence of fluorescence intensity on the Pb2+ concentration.

2.4 特異性實驗

為了進(jìn)一步考察該傳感器的選擇性,在相同條件下對其它金屬離子包括Na+,Li+,Al3+,Zn2+,Mn2+,Fe2+,Mg2+,Cu2+和Hg2+進(jìn)行了測試.在10 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3,2 mmol/L MgCl2)緩沖溶液中,加入200 nmol/L Pb2+適配體,10 μmol/L ThT,1 μmol/L Pb2+以及濃度均為1 μmol/L的其它金屬離子進(jìn)行實驗,平行測定3次.由圖5(A)可見,除Hg2+外,其它離子對Pb2+測定基本無干擾.因此,進(jìn)一步分析了Hg2+對Pb2+檢測的干擾.圖5(B)為加入Hg2+掩蔽劑SCN-后測得的干擾情況,可見Hg2+對Pb2+檢測的干擾很小.綜上,該傳感器對Pb2+具有良好的特異性.另外,對比文獻(xiàn)[15～19]報道的熒光傳感器或納米粒子對Pb2+的檢測結(jié)果(見表1)發(fā)現(xiàn),本文構(gòu)建的生物傳感器檢測Pb2+的檢出限(LOD)較低(1 nmol/L)、 時間較短(10 min).

Fig.5 Selectivity of the proposed method for Pb2+ detection Without(A) and with(B) masking reagent SCN- for Hg2+.The concentrations of the Pb2+ analogues were 1 μmol/L in the presence of 200 nmol/L Pb2+ aptamer and 10 μmol/L ThT,while the concentration of Pb2+ was 1 μmol/L.The blank was the sample without Pb2+ and only contains 200 nmol/L ATP aptamer and 10 μmol/L ThT.

Table 1 Comparison of analytical methods for the detection of Pb2+

MethodLOD/(nmol·L-1)Time/minRef. Gold Nano Alloy96 20 [15]Phage-AuNPs45 70 [16]DNA aptamers60.760 [17]Gold nanoparticles1320[18]DNA aptamers3.022 [19]G-quadruplex1.0 10This work

2.5 實際樣品中Pb2+的檢測

將該傳感器用于檢測自來水中的Pb2+含量,平行測定3次,測得樣品中的Pb2+含量為1.6 nmol/L.對同一樣品用ICP-MS檢測,平行測定3次,測得樣品中Pb2+含量為1.5 nmol/L.利用該生物傳感器檢測自來水樣中Pb2+的回收率列于表2,采用標(biāo)準(zhǔn)加入法平行測定3次,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均低于5.0%,回收率較好.綜上,所構(gòu)建的生物傳感器可用于分析實際水樣中的Pb2+.

Table 2 Determination of Pb2+ in real samples

3 結(jié) 論

構(gòu)建了一種基于ThT熒光分子誘導(dǎo)G-四聯(lián)體檢測Pb2+的熒光傳感方法.與化學(xué)標(biāo)記的熒光探針相比,該方法中的Pb2+適配體探針無需化學(xué)修飾,具有成本低、 靈敏度高、 操作簡單、 檢出限低及耗時短等優(yōu)點.