重組β-木糖苷酶轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb3及C-Mx

朱 鈴,王雨辰,趙江源,文孟良,李銘剛,韓秀林

(云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,云南省生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,教育部西南微生物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南省微生物研究所,昆明 650091)

人參皂苷(Ginsenoside)是人參(PanaxginsengC.A.Meyer)的主要活性成分之一[1].根據(jù)皂苷元側(cè)鏈上C3和C20位糖鏈種類和位置的不同,原人參二醇型皂苷(PPD)可分為Rb1,Rb2,Rb3,Rd和C-K等組分[2～4].其中,稀有人參皂苷如Rd和C-K易被人體吸收,具有治療糖尿病、 抗腫瘤、 抗高血壓、 抗過敏和保護(hù)神經(jīng)等藥理活性[5～10].但是天然稀有人參皂苷含量極少且缺乏穩(wěn)定的來源,其開發(fā)利用受到限制,這也是目前亟待解決的問題[11].通過對人參皂苷進(jìn)行水解反應(yīng)可以獲得稀有人參皂苷[12].目前,制備稀有人參皂苷的方法主要有微生物轉(zhuǎn)化[13]、 化學(xué)合成[14,15]和酶解法[16].其中,酶解法具有反應(yīng)條件溫和及不易破壞皂苷結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn).Yan等[17]發(fā)現(xiàn)并鑒定了一種β-葡萄糖苷酶(BlBG3),該酶屬于糖苷水解酶家族3(GH3),其對人參皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化率是重組β-葡萄糖苷酶(bglF3)的4倍.Kim等[18]發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶(BG-1)能斷裂人參皂苷Rb2的C3位上β-(1→2)糖苷鍵生成C—O和C—Y; 還可作用于Rb2的C20位上β-(1→6)糖苷鍵,伴隨阿拉伯吡喃糖的水解,生成稀有人參皂苷C-K.另外,Kim等[19,20]克隆了β-D-木糖苷酶,用于將人參皂苷Ra1和Ra2分別轉(zhuǎn)化為Rb2和Rc.目前,可將人參皂苷Rb3和C-Mx(C-Mx為Rb3水解中間產(chǎn)物)分別轉(zhuǎn)化為Rd和C-K的黑曲霉β-木糖苷酶尚未見報道.人參皂苷Rb3主要來源于三七莖葉地上部分,在從三七莖葉提取的總皂苷中所占質(zhì)量比高達(dá)30%[21].利用β-木糖苷酶開展人參皂苷Rb3制備稀有人參皂苷Rd和C-K的研究,可為三七地上部分活性物質(zhì)深度開發(fā)奠定基礎(chǔ),具備良好的產(chǎn)業(yè)化前景.

本文從AspergillusnigerNG1306菌株中擴(kuò)增獲得一個能夠轉(zhuǎn)化人參皂苷的β-木糖苷酶基因anxyl,并對該基因進(jìn)行了克隆、 重組表達(dá)載體pPICZαA-anxyl構(gòu)建、 宿主菌畢赤酵母KM71H轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)表達(dá)工作,系統(tǒng)研究了重組β-木糖苷酶Anxyl的酶動力學(xué)及酶學(xué)性質(zhì).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

人參皂苷Rb3,C-Mx和C-K購自云南與諾生物工程有限責(zé)任公司(純度>95%); 載體pEASY-T1 Simple,TransStartFastPfuDNA Polymerase,E.coliDH5αCompetent Cells和BluePlusⅢ Protein Marker(分子量14000～180000)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司; DL5000 DNA Marker和DL2000 DNA Marker購自昆明碩陽科技有限公司; T4 DNA連接酶和限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ,XbaⅠ購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司; 限制性內(nèi)切酶PmeⅠ購自美國New England BioLabs(NEB)公司; 原始AspergillusnigerNG1306菌株、 表達(dá)宿主菌株KM71H和質(zhì)粒pPICZαA均為本實(shí)驗(yàn)室保存樣本; 除高效液相色譜(HPLC)用甲醇或乙腈為色譜純外,其它試劑均為分析純,購自昆明品美科技有限公司.

ABI Veriti型梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增儀,德國Biometra公司; Syngene型凝膠成像儀,英國Gene公司; D-78532型高速冷凍離心機(jī),德國Hettich公司; Legend Micro 17型高速臺式離心機(jī),美國Thermo公司; PowerPacTMHC型聚丙烯酰胺凝膠電泳儀,美國BIO-RAD公司; Agilent HPLC1100型高效液相色譜分析(HPLC)儀,美國Agilent公司; EasyChrom-1000型高效液相色譜制備工作站,江蘇漢邦科技有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Anxyl序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 對源于黑曲霉的3個木糖苷酶基因(JX535027.1,AF108944.1和KR296923.1)保守區(qū)域進(jìn)行分析,設(shè)計(jì)出2個特異性引物anxyl-F(5′-ATGGCGCACTCAATGTCTCGTC-3′)和anxyl-R(5′-CTCCTTCCCCGGCCACTTC-3′)來擴(kuò)增目的基因anxyl并測序.基因序列用Primer Premier 5.0翻譯成氨基酸序列后通過NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)和CAZy(www.cazy.org)數(shù)據(jù)庫檢索,經(jīng)Clustal 2.1比對,采用MEGA X鄰接法構(gòu)建氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹[22,23],并最終對相應(yīng)的氨基酸序列通過EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫檢索進(jìn)行驗(yàn)證.

1.2.2β-木糖苷酶基因anxyl的克隆、 表達(dá)與純化 在28 ℃及180 r/min條件下培養(yǎng)AspergillusnigerNG1306菌株72 h,備用.采用SDS-EDTA-Tris(SET)法提取菌株基因組DNA[24].用特異性引物anxyl-F和anxyl-R擴(kuò)增β-木糖苷酶基因anxyl,根據(jù)目的基因序列,采用SnapGene分析目的基因和表達(dá)載體pPICZαA酶切位點(diǎn),重新設(shè)計(jì)適宜基因克隆的PCR引物(同時具備EcoRⅠ和XbaⅠ 2個酶切位點(diǎn)),并擴(kuò)增目的基因anxyl.用EcoRⅠ和XbaⅠ對目的基因和表達(dá)載體pPICZαA同時進(jìn)行雙酶切,構(gòu)建表達(dá)載體pPICZαA-anxyl.

將構(gòu)建好的質(zhì)粒pPICZαA-anxyl用限制性內(nèi)切酶PmeⅠ線性化,將DNA瓊脂糖凝膠回收后電擊轉(zhuǎn)化到畢赤酵母KM71H中.將轉(zhuǎn)化菌涂布到含有博來霉素(100 μg/mL)的Yeast extract peptone dextrose(YPD)固體篩選培養(yǎng)基上,于28 ℃培養(yǎng)3 d后挑取轉(zhuǎn)化子.將轉(zhuǎn)化子接種到含有Zeocin(100 μg/mL)的YPD液體培養(yǎng)基中,于30 ℃及180 r/min條件下培養(yǎng)2 d.將培養(yǎng)物在5000 r/min轉(zhuǎn)速下離心收集菌體,用SET法提取基因組,并用特異性引物PCR擴(kuò)增目的基因并驗(yàn)證是否正確整合.對正確整合到畢赤酵母KM71H的重組表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)[25].

采用硫酸銨鹽析沉淀、 透析(6 mm透析袋檸檬酸緩沖液透析過夜)及超濾(截留分子量50000超濾管)對Anxyl進(jìn)行多次分級純化[26].目的蛋白純度通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白質(zhì)條帶分析進(jìn)行驗(yàn)證[27].蛋白濃度采用Bradford方法測定[28].

1.2.3 Anxyl的表征 選用底物對硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(pNPX)測定Anxyl的活性[29].酶活定義為: 在酶最適作用條件下,每分鐘催化水解pNPX生成1 μmolpNP所需要的酶量定為1 U.

在磷酸緩沖液[30](50 mmol/L,pH=7.0)中,考察了溫度、 pH[31,32]及葡萄糖和木糖濃度[33]對酶活的影響.通過添加不同的金屬離子和化學(xué)試劑,考察其對Anxyl酶活性的影響[34].在不同濃度乙醇條件下,研究了乙醇對Anxyl活性的影響[33].

選用不同濃度pNPX,人參皂苷Rb3及C-Mx作為底物,采用用雙倒數(shù)作圖法[35]計(jì)算Anxyl對不同底物的動力學(xué)常數(shù)---米氏常數(shù)(Km,mmol/L),最大反應(yīng)速度(Vmax,mmol/min)和酶的轉(zhuǎn)換數(shù)(Kcat,s-1).

1.2.4 重組酶對人參皂苷Rb3和C-Mx的轉(zhuǎn)化及產(chǎn)物分析 人參皂苷Rb3和C-Mx經(jīng)Anxyl轉(zhuǎn)化后,將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用高效液相色譜制備工作站進(jìn)行純化獲得純品,并進(jìn)行質(zhì)譜(MS)與核磁共振波譜(NMR)分析[36].將人參皂苷反應(yīng)混合體系在30 ℃下反應(yīng)1 h后,加入100 μL正丁醇萃取,萃取產(chǎn)物同時進(jìn)行薄層色譜(TLC)定性,展開劑組成:V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=70∶30∶5,顯色劑組成:V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)∶V(濃硫酸)=85∶10∶5,顯色溫度80 ℃,并用HPLC定量分析[37].根據(jù)HPLC的峰面積計(jì)算人參皂苷Rb3,C-Mx,Rd和C-K反應(yīng)前后的含量.Rd的轉(zhuǎn)化率(%)為轉(zhuǎn)化后Rd含量與Rb3初始含量的百分比; C-K的轉(zhuǎn)化率(%)為轉(zhuǎn)化后C-K含量與C-Mx初始含量的百分比.

2 結(jié)果與討論

2.1 Anxyl序列分析

通過PCR擴(kuò)增獲得anxyl基因全長為2415 bp,編碼805個氨基酸(表S1,見本文支持信息).在數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)代表性木糖苷酶家族氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(Scheme 1).β-木糖苷酶系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示有7個分支.分支Clade Ⅰ和Ⅱ主要包括源于細(xì)菌和真菌的GH43和GH3家族β-木糖苷酶; 分支Clade Ⅲ～Ⅵ則主要包括源于細(xì)菌的GH52,GH30,GH39和GH1家族β-木糖苷酶; 分支Clade Ⅶ主要包括源于康氏木霉的GH54家族β-木糖苷酶.經(jīng)進(jìn)化樹分析并通過EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫檢索驗(yàn)證,表明獲得的重組蛋白Anxyl與GH3家族β-木糖苷酶相似性較高,可以進(jìn)一步對該基因進(jìn)行克隆表達(dá),以驗(yàn)證其功能.

Scheme 1 Phylogentic tree results from the analysis of 25 β-xylosidase amino acid sequences using Neighbor-Joining(NJ) method Numbers on nodes correspond to percentage bootstrap values for 1000 replicates.

2.2 Anxyl基因的異源表達(dá)及相應(yīng)蛋白的純化

Fig.1 Digestion of the recombinant plasmid pPICZαA-anxyl by EcoRⅠ and XbaⅠ Lane M: DL 5000 marker; lane1: pPICZαA plasmid; lane 2: pseudopositive plasmid;lane3: recombinant plasmid.

根據(jù)目的基因anxyl序列和pPICZαA載體上的多克隆位點(diǎn)分析選擇EcoRⅠ和XbaⅠ 2個酶切位點(diǎn),設(shè)計(jì)出另一對適宜基因克隆操作的PCR引物: xyl-F(5′-CGGAATTCGCCACCATGGCGCACTCAATGTCTCGTC-3′,下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))和xyl-R(5′-GCTCTAGACTCCTTCCCCGGCCACTTC-3′,下劃線部分為XbaⅠ酶切位點(diǎn)).提取AspergillusnigerNG1306基因組(圖S1,見本文支持信息).通過PCR擴(kuò)增,獲得的目的基因anxyl大小為2415 bp(圖S2,見本文支持信息).對目的基因和載體pPICZαA進(jìn)行酶切連接后轉(zhuǎn)化到DH5α中,經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切驗(yàn)證(圖1).可見,空質(zhì)粒pPICZαA酶切后產(chǎn)生的片段為3593(圖1中l(wèi)ane 1); 假陽性質(zhì)粒酶切后產(chǎn)生的片段為3593(圖1中l(wèi)ane 2); 重組成功的質(zhì)粒酶切后產(chǎn)生3593(空載體)和2415(目的基因)2個片段(圖1中l(wèi)ane 3),大小與預(yù)期一致,表明已獲得pPICZαA-anxyl表達(dá)載體.

用限制性內(nèi)切酶PmeⅠ將質(zhì)粒pPICZαA-anxyl線性化并電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71H(圖S3,見本文支持信息).轉(zhuǎn)化子KM71H-Anxyl經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)并進(jìn)行相應(yīng)蛋白純化.經(jīng)SDS-PAGE檢測,目的蛋白分子量約為176480,與預(yù)期數(shù)值大小一致(圖S4,見本文支持信息),純化后Anxyl的比活力(Specific activity,U·mg-1)是粗酶液的250倍,純化回收率為0.05%(見表1).

Table 1 Purification summary for the recombinant Anxyl*

* Substrate for Anxyl activity deteaction wasp-nitrophenyl-β-xylopyranoside.

2.3 以pNPX為底物的Anxyl的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 pH和溫度對Anxyl酶活的影響 將純化后酶液(Anxyl)與pH=2～9的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液等體積混合,于30 ℃反應(yīng)10 min后測定酶活.以相同條件下已滅活的酶液作為對照,假定最高酶活力為100%,測定Anxyl的最適pH.由圖2(A)可知,Anxyl的最適pH值為2.5.該酶在pH=2.0～4.5條件下,相對酶活超過80%,pH>4.5后,相對酶活逐漸下降.將純化后酶液(Anxyl)在不同pH值下放置1 h后,測定剩余酶液活性,以未處理的酶液的酶活為100%.由圖2(B)可知,在30 ℃,不同pH(2.0～5.0)條件下放置1 h后,Anxyl仍具有較好的穩(wěn)定性,相對酶活超過80%.由圖2(C)可知,該酶在20～40 ℃具有較高的酶活,超過40 ℃后酶活急劇下降,Anxyl的最適作用溫度為35 ℃.圖2(D)結(jié)果表明,在pH=7.0條件下,1 h內(nèi),Anxyl在20和30 ℃環(huán)境中,其殘余活性保持在80%以上,具有較好的熱穩(wěn)定性.

Fig.2 Effects of pH(A,B) and temperatures(C,D) on the activity(A,C) and stability(B,D) of recombinant Anxyl determined using pNPX as a substrate

2.3.2 金屬離子、 化學(xué)試劑及乙醇對Anxyl酶活的影響 表2列出了金屬離子和化學(xué)試劑對Anxyl酶活性的影響.可見,Mg2+對Anxyl相對酶活的提高具有促進(jìn)作用,Cu2+則對Anxyl活性呈明顯抑制效應(yīng),Ca2+和Ni2+對Anxyl酶活有一定抑制作用,Na+,K+,Ca2+,Co2+和Ni2+隨著濃度增加對酶活影響不大.化學(xué)試劑乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)和十二烷基硫酸鈉(SDS)在高濃度條件下對Anxyl有一定抑制作用; 二硫蘇糖醇(DTT)對Anxyl酶活影響不明顯.表3列出了木糖、 葡萄糖和乙醇對Anxyl酶活性的影響.可見,乙醇對Anxyl酶活性有較大影響,當(dāng)反應(yīng)體系中乙醇濃度>1.5 mol/L時,酶活性快速下降.Anxyl對葡萄糖具有較高的耐受性,反應(yīng)體系中葡萄糖濃度達(dá)到1 mol/L時Anxyl相對酶活仍可保持在95%以上; 而木糖則對Anxyl活性有較大影響,隨著木糖濃度增加Anxyl酶活快速降低,當(dāng)木糖濃度>0.8 mol/L時,酶活基本被完全抑制.

Table2Effectsofmetalcationsandreagentsontherelativeenzymeactivity(%)ofAnxyl

Metal cation/reagentRelative enzyme activity(%)10 mmol/L50 mmol/L100 mmol/LNaCl156±0.02162±0.08148±0.08KCl123±0.34119±0.21125±0.02MgCl2105±0.06153±0.02161±0.02CuCl2116±0.07107±0.0655±0.15CaCl292±0.0890±0.0798±0.10CoCl2103±10.05108±0.0697±0.24NiCl283±0.2183±0.2996±0.08SDS118±0.3298±0.0233±0.23EDTA-Na296±0.0250±0.0233±0.08DTT92±0.0599±0.0994±0.01

Table3EffectsofD-xylose,glucoseandethanolontherelativeenzymeactivity(%)ofAnxyl

Concentration/(mol·L-1)Relative enzyme activity(%)D-XyloseGlucoseEthanol0100±0.08100±0.02100±0.050.259±0.3099±0.04Not detected0.457±0.6796±0.08Not detected0.651±0.0595±0.02Not detected0.87±0.4295±0.0799±0.7215±0.0599±0.0497±0.131.5Not detectedNot detected96±0.063Not detectedNot detected77±0.125Not detectedNot detected52±0.057Not detectedNot detected22±0.21

2.3.3 以pNPX為底物的酶學(xué)動力學(xué)參數(shù)分析 根據(jù)獲得的Anxyl催化pNPX水解Lineweaver-Burk曲線(圖S5,見本文支持信息)進(jìn)行Anxyl酶動力學(xué)參數(shù)計(jì)算,所得Km,Vmax和Kcat值分別為3.1 mmol/L,0.02 mmol/min和5.55 s-1.

2.4 以人參皂苷Rb3及C-Mx為底物的Anxyl的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及酶轉(zhuǎn)化性能分析 在pH=2.5及30 ℃條件下,分別向100 μL Anxyl純化酶液中投加天然底物Rb3和C-Mx,起始濃度均為1.0 mg/mL,催化反應(yīng)1 h后,進(jìn)行TLC定性檢測(圖3)及HPLC檢測(圖S6,見本文支持信息).可見,Anxyl可將人參搭皂苷Rb3和C-Mx分別轉(zhuǎn)化為不同產(chǎn)物.目標(biāo)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜(圖S7,見本文支持信息)與核磁共振碳譜(圖S8,見本文支持信息)分析后確定為人參皂苷Rd及C-K.

Fig.3 TLC detection of enzyme reaction products with different substrates Rb3,Rd,C-Mx,C-K: standard ginsenosides.Lane 1: control; lane 2: enzyme reaction product.

人參皂苷Rb3經(jīng)Anxyl酶轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物的表征數(shù)據(jù)如下: ESI(+)-MS,m/z([M]=947): 1917 [2M+Na]+,970 [M+Na]+; 配糖體,13C NMR(125 MHz,Pyridine-d5),δ: 40.1(C1),27.5(C2),89.9(C3),40.6(C4),57.3(C5),19.3(C6),36.0(C7),40.9(C8),51.1(C9),37.8(C100,31.7(C11),71.2(C12),50.3(C13),52.3(C14),31.7(C15),27.5(C16),52.6(C17),17.1(C18),16.8(C19),84.2(C20),23.3(C21),37.0(C22),24.2(C23),126.2(C24),131.2(C25),26.6(C26),18.7(C27),29.0(C28),17.5(C29),18.2(C30); C3-O-內(nèi)葡萄糖,13C NMR(125 MHz,Pyridine-d5),δ: 105.9(C1′),84.2(C2′),79.2(C3′),72.4(C4′),78.8(C5′),63.7(C6′); C-3-O-外葡萄糖,13C NMR(125 MHz,Pyridine-d5),δ: 106.8(C1″),77.9(C2″),80.0(C3″),72.5(C4″),78.9(C5″),63.7(C6″); C20-O-葡萄糖,13C NMR(125 MHz,Pyridine-d5),δ: 99.1(C1′),76.0(C2′),79.1(C3′),72.6(C4′),79.1(C5′),63.7(C6′).確定該產(chǎn)物的分子式為C48H82O18,其13C NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[38]報道的人參皂苷Rd一致,故鑒定該化合物為3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人參二醇.

人參皂苷C-Mx經(jīng)Anxyl酶轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物的表征數(shù)據(jù)如下: ESI(+)-MS,m/z([M] =622): 1268[2M+Na]+,645[M+Na]+; 配糖體,13C NMR(125 MHz,Pyridine-d5),δ: 39.1(C1),27.9(C2),77.8(C3),39.2(C4),56.1(C5),18.5(C6),34.9(C7),39.8(C8),50.0(C9),37.1(C10),30.5(C11),69.9(C12),49.2(C13),51.1(C14),30.6(C15),26.3(C16),51.4(C17),16.0(C18),15.7(C19),83.0(C20),22.1(C21),35.8(C22),22.9(C23),125.6(C24),130.6(C25),25.4(C26),17.5(C27),28.4(C28),16.0(C29),17.1(C30); C20-O-葡萄糖,13C NMR(125 MHz,Pyridine-d5),δ: 97.9(C1′),74.8(C2′),78.9(C3′),71.3(C4′),77.9(C5′),62.5(C6′).確定該產(chǎn)物的分子式為C36H62O8,其13C NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[39]報道的人參皂苷C-K一致,故鑒定該化合物為20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人參二醇.

HPLC定量檢測結(jié)果(圖S6)表明,由Rb3到Rd(0.25 mg/mL)的轉(zhuǎn)化率為25%; C-Mx到C-K(0.13 mg/mL)的轉(zhuǎn)化率為12.5%.據(jù)此可推測,獲得的Anxyl通過切割人參皂苷Rb3位于C20位的外部木糖部分實(shí)現(xiàn)Rb3到Rd的生物轉(zhuǎn)化; 而通過切割人參皂苷C-Mx位于C20位的外部木糖部分則可實(shí)現(xiàn)C-K的生物轉(zhuǎn)化,如Scheme 2所示.

Scheme 2 Biotransfomation pathways from Rb3 to Rd and C-Mx to C-K by Anxyl

2.4.2 以Rb3及C-Mx為底物的酶學(xué)動力學(xué)參數(shù)分析 根據(jù)獲得的Anxyl催化人參皂苷Rb3及C-Mx水解Lineweaver-Burk曲線(圖S9和S10,見本文支持信息)進(jìn)行了Anxyl酶動力學(xué)參數(shù)計(jì)算.結(jié)果表明,該酶對天然底物Rb3的Km,Vmax和Kcat值分別為1.55 mmol/L,0.8×103mmol/min和0.17 s-1; 該酶對天然底物C-Mx的Km,Vmax和Kcat值分別為1.04 mmol/L,8×103mmol/min和1.85 s-1.以上酶學(xué)動力學(xué)數(shù)據(jù)表明,Anxyl對天然底物Rb3和C-Mx具有更高的親和力.

另外,利用該酶對其它人參皂苷如Rb1,Rb2,Rc,Rd,Rg1和Re(結(jié)構(gòu)見表S2,見本文支持信息)進(jìn)行催化反應(yīng),經(jīng)TLC分析,均未檢測到新轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(圖S11,見本文支持信息).這表明Anxyl對不含木糖苷的其它人參皂苷無催化活性,表現(xiàn)出較強(qiáng)的專一性.

3 結(jié) 論

從AspergillusnigerNG1306菌株中克隆到1個β-木糖苷酶基因anxyl,并在宿主菌畢赤酵母KM71H中進(jìn)行了重組表達(dá).表達(dá)的重組蛋白Anxyl具有β-木糖苷酶活性,屬于GH3家族.酶學(xué)表征結(jié)果顯示,重組Anxyl在偏酸性環(huán)境中具有較適中的作用溫度且穩(wěn)定性較好; Mg2+對該酶活性的提高具有促進(jìn)作用; 該酶對葡萄糖具有較高的耐受性.由于人參皂苷Rb3形成的中間產(chǎn)物Rd和C-Mx的水溶解度低,故酶促反應(yīng)無法實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化.獲得的重組Anxyl可將來源于三七莖葉中的人參皂苷Rb3轉(zhuǎn)化為Rd,并可進(jìn)一步將C-Mx轉(zhuǎn)化為C-K,其中C-Mx為β-葡萄糖苷酶水解人參皂苷Rb3位于C3位2個葡萄糖的產(chǎn)物.本文結(jié)果為開展三七莖葉活性成分的深度開發(fā)奠定了基礎(chǔ).

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20190626.