基于拉曼光譜的細(xì)菌檢測研究進(jìn)展

李文帥,武國瑞,張茜菁,岳愛琴,杜維俊,趙晉忠,劉定斌

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院,2.農(nóng)學(xué)院,太谷 030800;3.南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院,藥物化學(xué)生物學(xué)國家重點實驗室,天津 300350)

拉曼光譜(Raman spectroscopy)是一種散射光譜,其基于拉曼散射效應(yīng),將光束照射到被檢測物上,光子與被檢測物相互作用產(chǎn)生散射光,通過測量分子振動或轉(zhuǎn)動能級差的特征頻移來反映物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分[1].拉曼光譜又稱作分子“指紋”光譜,能夠?qū)悠愤M(jìn)行原位、 非侵入、 無標(biāo)記檢測,應(yīng)用范圍涉及化學(xué)、 物理學(xué)、 生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域,對于定性分析、 定量分析和分子結(jié)構(gòu)測定均具有較大應(yīng)用價值[2].

細(xì)菌是自然界中數(shù)量最多、 分布最廣、 形態(tài)多樣且具有特殊結(jié)構(gòu)的一類微生物.經(jīng)過長期的自然演變,細(xì)菌與各物種之間建立了復(fù)雜的拮抗或共生關(guān)系[3].細(xì)菌不僅會引起寄主發(fā)生某些特定疾病,還能作為條件致病菌,當(dāng)宿主免疫力低下、 機體屏障被破壞時發(fā)生菌群失調(diào)或細(xì)菌移位,從而釋放多種毒力因子,造成機體的嚴(yán)重感染[4,5].隨著抗生素應(yīng)用日益增多,細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重,細(xì)菌性疾病治療失敗率升高,導(dǎo)致發(fā)病率和病死率增高以及用藥費用增加.當(dāng)前,細(xì)菌耐藥已經(jīng)成為全球公共健康領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn),也是各國政府和社會廣泛關(guān)注的世界性難題[6].

目前,拉曼光譜在細(xì)菌檢測領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用,能夠進(jìn)行快速、 簡單、 可重復(fù)且無損傷的定性定量分析.本文將拉曼光譜在細(xì)菌檢測領(lǐng)域的應(yīng)用分為以下3個方面: (1) 鑒別細(xì)菌表面特異性分子,直接獲取細(xì)菌拉曼光譜信息,簡單快速實現(xiàn)細(xì)菌分型; (2) 依賴不同種類細(xì)菌的代謝和生理差異,通過檢測細(xì)菌攝取和代謝物質(zhì)間接實現(xiàn)細(xì)菌的鑒別; (3) 借助具有靶向性的貴金屬納米探針,顯著提升細(xì)菌檢測的靈敏度和分辨率.拉曼光譜檢測憑借其高特異性、 無需樣本處理的優(yōu)勢,在臨床檢測、 工業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境監(jiān)測等方面顯示出巨大發(fā)展?jié)摿?

1 拉曼光譜檢測的原理及應(yīng)用

拉曼散射是由光照射到物質(zhì)表面引發(fā)的非彈性散射現(xiàn)象.如圖1所示,當(dāng)單色光束的入射光光子與被檢測物分子相互作用時,可同時產(chǎn)生彈性碰撞和非彈性碰撞,在彈性碰撞過程中,光子運動方向改變而頻率不變,且光子與被檢測物分子不發(fā)生能量交換,這種散射叫做瑞利散射; 而在非彈性碰撞過程中,光子與被檢測分子進(jìn)行了能量交換,在光子改變運動方向的同時,其一部分能量傳遞給被檢測分子(斯托克斯散射),或者被檢測分子的振動和轉(zhuǎn)動能量傳遞給光子(反斯托克斯散射),從而改變了光子的頻率,這種散射就叫作拉曼散射[7].

Fig.1 Rayleigh(elastic) and Raman(inelastic) scattering at a molecule,and scattering intensity dependence on the wavelength of the scattered light(for ease of comparison,the scattering intensity is arbitrarily set to 1 at a wavelength of 532 nm)[7] Copyright 2013,Annual Reviews.

拉曼檢測技術(shù)的發(fā)展存在二次重大變革.由于拉曼散射光子數(shù)約為瑞利散射的千分之一,導(dǎo)致拉曼檢測的信號極其微弱,研究初期甚至難以得到一張較為完整的拉曼譜圖.上個世紀(jì)60年代激光器的問世為拉曼檢測提供了具有優(yōu)異單色性、 方向性、 亮度高以及相干性好的光源,顯著提高了檢測靈敏度,縮短了信號采集時間.此外,1974年Fleischmann等[8]發(fā)現(xiàn)吸附在粗糙Ag電極表面的吡啶分子具有顯著的拉曼散射效應(yīng),加之活性載體表面選擇吸附分子對熒光發(fā)射的抑制,使激光拉曼光譜分析的信噪比大大提高,表面增強拉曼光譜(Surface-enhanced Raman scattering,SERS)技術(shù)就此誕生(圖2).利用在可見光-近紅外波段具有很強表面等離激元共振效應(yīng)的Ag及Au等納米結(jié)構(gòu),可顯著增強吸附在納米結(jié)構(gòu)表面分子的拉曼信號,從而以超高檢測靈敏度獲得樣品自身的指紋特征.納米科技的迅猛發(fā)展促進(jìn)了SERS和針尖增強拉曼光譜(Tip enhanced Raman scattering,TERS)的發(fā)展,推動其在高靈敏甚至單分子水平檢測方面的應(yīng)用[9～11].目前,最常用的拉曼檢測技術(shù)可分為顯微共聚焦拉曼光譜技術(shù)、 表面增強拉曼光譜技術(shù)、 共振增強拉曼光譜技術(shù)和傅里葉變換拉曼光譜技術(shù).

Fig.2 Representative electric field distribution of SERS-active Au nanoparticles Note that the SERS “hot-spot” is generated in the gap between two closely arranged nanoparticles(A)[9],and collective oscillations of electrons in a spherical nanoparticle under the action of the external electric field(B)[10].(A) Copyright 2018,Wiley-VCH;(B) Copyright 2017,MDPI.

拉曼光譜技術(shù)因其制樣簡單、 檢測快速、 信息豐富及可在水溶液中測試等優(yōu)勢,而在化學(xué)、 物理、 高分子材料、 生物、 醫(yī)藥與地質(zhì)等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用.(1) 在有機化學(xué)領(lǐng)域,拉曼光譜主要作為分子結(jié)構(gòu)鑒定的手段.拉曼位移的大小、 強度及拉曼峰的形狀是表征化學(xué)鍵、 官能團(tuán)的重要依據(jù).值得一提的是,利用拉曼光譜的偏振特性還可判別物質(zhì)的順反式結(jié)構(gòu).與紅外光譜互為補充,可以鑒別特殊的結(jié)構(gòu)特征或特征基團(tuán)[12～14].(2) 在無機化學(xué)領(lǐng)域,金屬離子與配體形成的共價鍵通常具有拉曼活性,通過拉曼光譜檢測可得到其配位化合物的組成、 結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性等信息[15].(3) 在催化化學(xué)領(lǐng)域,拉曼光譜可以實時監(jiān)測反應(yīng)過程中各種物質(zhì)的動態(tài)變化[16].(4) 在電化學(xué)領(lǐng)域,拉曼光譜是研究電極/溶液界面結(jié)構(gòu)和性能的重要手段,有利于在分子層面研究電化學(xué)界面結(jié)構(gòu)、 吸附和反應(yīng)等基礎(chǔ)問題[17～20].(5) 在高分子材料領(lǐng)域,拉曼光譜可以提供聚合物材料結(jié)構(gòu)信息.在確定異構(gòu)體的研究中具有其獨特的作用,且拉曼譜峰的寬度可以直接反映高分子材料的純度[21].(6) 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,拉曼光譜是研究生物大分子的有力手段,由于水幾乎沒有拉曼峰,被檢測物可以在自然狀態(tài)下直接進(jìn)行研究和檢測,無光漂白,能實時監(jiān)測生物大分子的結(jié)構(gòu)及其變化,包括蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、 無規(guī)卷曲及β-回轉(zhuǎn))、 蛋白質(zhì)主鏈及側(cè)鏈構(gòu)像(酰胺Ⅰ和Ⅲ,C—C,C—N伸縮振動)、 脂類和核酸[22～25]等.(7) 在中草藥研究領(lǐng)域,可應(yīng)用于中草藥化學(xué)成分分析、 中草藥的無損鑒別、 中草藥的穩(wěn)定性研究(監(jiān)測藥物衰敗過程)以及藥理研究[26].(8) 在寶石和文物的研究和鑒定領(lǐng)域,拉曼光譜能夠快速、 無損鑒定寶石的類別和純度,或在文物鑒定過程中提供科學(xué)依據(jù)[27].

拉曼光譜的產(chǎn)生是入射光子與被測分子相互碰撞時,分子的振動能量或轉(zhuǎn)動能量與光子能量疊加的結(jié)果,利用拉曼光譜可以把處于紅外區(qū)的分子能譜轉(zhuǎn)移至可見光區(qū)來觀測.因此,拉曼光譜作為紅外光譜的補充,是研究分子結(jié)構(gòu)的有力武器.其優(yōu)勢體現(xiàn)在用拉曼光譜研究水溶液比較方便,而生命科學(xué)的許多研究通常需要水溶液環(huán)境.與經(jīng)典的熒光分析方法相比,拉曼光譜沒有光漂白現(xiàn)象,其信號產(chǎn)生不受復(fù)雜生理環(huán)境的影響,無需進(jìn)行樣品前處理,可直接在水或生物流體中檢測,能進(jìn)行多靶標(biāo)同時檢測和單分子檢測.共振拉曼光譜、 表面增強拉曼光譜和非線性拉曼光譜及其聯(lián)用將成為生命科學(xué)前沿領(lǐng)域的重要研究方法.

2 細(xì)菌檢測的意義及現(xiàn)狀

細(xì)菌最早是由荷蘭人列文虎克在一位從未刷過牙的老人牙垢上發(fā)現(xiàn)的,隨后由德國科學(xué)家埃倫伯格在1828年命名.細(xì)菌按形狀可分為球菌、 桿菌以及螺旋菌.在人類活動過程中細(xì)菌扮演著不同的角色: 一方面,細(xì)菌是許多疾病的病原體,包括肺結(jié)核、 淋病、 炭疽病、 梅毒、 鼠疫和沙眼等; 另一方面,人類也利用細(xì)菌進(jìn)行乳酪和酸奶等發(fā)酵食物的制作、 抗生素的生產(chǎn)以及廢料、 廢水的處理等.細(xì)菌廣泛分布于土壤和水中,也可寄生或者與其它生物共生.人體內(nèi)及表皮上的細(xì)菌總數(shù)約是人體細(xì)胞總數(shù)的10倍[28].很多細(xì)菌均具有致病性,在宿主免疫力低下、 機體屏障功能被破壞時,宿主就會被細(xì)菌感染.革蘭氏陰性菌通過鞭毛的運動,黏附、 定植在宿主細(xì)胞表面,進(jìn)而通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)將毒力蛋白轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞,造成機體感染.革蘭氏陽性菌及部分革蘭氏陰性菌能夠分泌致病性強、 致死性強和組織親和性高的可溶性蛋白質(zhì),可侵入人體特定的器官和組織,進(jìn)而在機體內(nèi)環(huán)境中擴(kuò)散,激活T淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子,造成不同程度的臨床癥狀和病變[29].最常見的致病菌為革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌、 化膿性鏈球菌、 肺炎鏈球菌,以及革蘭氏陰性的如大腸桿菌、 流感嗜血桿菌等.細(xì)菌感染是導(dǎo)致發(fā)病和死亡的主要原因,是幾乎所有醫(yī)學(xué)學(xué)科中最常見的問題.由于人口日益老齡化引起的平均免疫力降低,不斷增加的生物材料、 生物制劑的需求及更加頻繁的器官移植,尤其是細(xì)菌對抗生素的抗藥性增強,均導(dǎo)致細(xì)菌感染發(fā)病率不斷上升.迄今,抗菌藥物耐藥性(Antimicrobial resistance,AMR)已成為 21 世紀(jì)主要的公共衛(wèi)生健康問題,是對人類健康的最大威脅之一[30].在過去50年里,臨床醫(yī)學(xué)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中濫用抗生素加速了細(xì)菌耐藥性的傳播,導(dǎo)致全球每年有超過70萬人死亡,醫(yī)療費用和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)每年增加350億美元.預(yù)計到2050年,每年死于耐藥菌感染的人數(shù)將增加到1000萬人,花費約100萬億美元[31].細(xì)菌檢測對現(xiàn)代醫(yī)療實踐至關(guān)重要,快速診斷耐藥感染和藥敏試驗(Antimicrobial susceptibility test,AST)是正確使用抗生素的保證,也是減緩細(xì)菌耐藥性蔓延的重要途徑.體外抗菌藥物敏感性實驗是指在體外測定藥物抑菌或殺菌能力的實驗方法,主要有紙片擴(kuò)散法、 稀釋法(包括瓊脂和肉湯稀釋法)、 抗生素濃度梯度法(E-test法)和自動化儀器法等[32].

目前,科學(xué)家已開發(fā)出多種細(xì)菌檢測新技術(shù),如質(zhì)譜分析法[33,34]、 聚合酶連鎖反應(yīng)[35,36]及熒光原位雜交技術(shù)[37,38]等,并將其廣泛用于微生物的表型鑒定,但這些檢測方法存在成本高、 操作復(fù)雜、 對操作者要求較高及耗時長等缺點[39,40].因此,傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)和表型鑒定技術(shù)依然占據(jù)主導(dǎo)地位,但其缺點在于: (1) 細(xì)菌培養(yǎng)耗時長(24～72 h),在臨床上往往錯過最佳治療時間.例如,在膿毒性休克患者中,有效的抗生素治療每推遲1 h存活率將下降7.6%[41].(2) 對于某些厭氧菌和難以體外培養(yǎng)的致病菌,將無法進(jìn)行鑒定.因此,開發(fā)快速、 準(zhǔn)確的細(xì)菌鑒定新技術(shù)尤為緊迫.拉曼光譜具備無損檢測、 高分辨、 無需細(xì)菌培養(yǎng)、 制樣簡單和檢測速度快等優(yōu)點,已經(jīng)成為了一種非常有效的細(xì)菌檢測方法.拉曼光譜相比于熒光分析具備無損檢測的特性,可對細(xì)菌特定的生理過程進(jìn)行監(jiān)測,為細(xì)菌異質(zhì)性研究和細(xì)菌感染治療提供了技術(shù)手段.在日常的生產(chǎn)生活中,可借助手持拉曼儀對細(xì)菌進(jìn)行檢測,通過對比細(xì)菌拉曼光譜數(shù)據(jù)庫得到檢測報告,無需昂貴的設(shè)備和專業(yè)的測試人員,真正實現(xiàn)簡單、 快速的細(xì)菌檢測.

3 拉曼光譜檢測細(xì)菌的3種方式

3.1 無標(biāo)記拉曼光譜檢測細(xì)菌表面特異性分子

細(xì)菌的外膜攜帶著與菌株生長、 刺激表達(dá)、 甚至地理差異有關(guān)的特定分子信息.在拉曼光譜發(fā)展的早期階段,就有學(xué)者陸續(xù)報道了多種生物分子的拉曼信號.Bronk等[42]首次報道了細(xì)菌的SERS譜圖,顯示革蘭氏陰性菌和陽性菌細(xì)胞表面的SERS信號存在差異,正式開啟了利用拉曼光譜技術(shù)檢測細(xì)菌的研究(圖3).

Fig.3 Exemplary SERS spectra of Gram-negative(a) and Gram-positive(b) bacterial cells[42] Copyright 2002,Elservier.

Fig.4 Difference in Raman spectra of sulfur bacteria(a) and sulfur-deficient bacteria(b)[45] Copyright 2015,Oxford University Press.

由于細(xì)菌表面化學(xué)成分存在差異,直接利用細(xì)菌的原位檢測信號來鑒別細(xì)菌無疑是最直接和理想的方法.但是,直接檢測細(xì)菌表面拉曼信號弱,峰多且峰形、 峰位相近,裸眼區(qū)別率低,無法獲得理想的鑒別效果.況且,同種屬細(xì)菌的拉曼信號亦有差別,如Maquelin等[46]將腐生葡萄球菌在波數(shù)1180～1090 cm-1處的拉曼峰指認(rèn)為蛋白質(zhì)的信號; 而對于表皮葡萄球菌,更多是DNA和RNA的分子振動.同時,不同的培養(yǎng)條件和拉曼測試方法獲得的細(xì)菌拉曼光譜也存在明顯差異.細(xì)菌的拉曼譜圖包含了細(xì)菌所有組成成分的振動光譜信息,當(dāng)所處的環(huán)境狀態(tài)發(fā)生改變時,會影響拉曼光譜的重現(xiàn)性.若測定對象為單個菌落時,單菌落的異質(zhì)性也會影響結(jié)果的重現(xiàn)性.Choo-Smith等[47]分別研究了培養(yǎng)6,10和24 h的菌落,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)6 h的菌落不存在異質(zhì)性.Kunapareddy等[48]利用多波長共振拉曼光譜研究了培養(yǎng)條件對細(xì)菌分類結(jié)果的影響,發(fā)現(xiàn)檢測對數(shù)生長期的細(xì)菌比穩(wěn)定期的更容易得到正確結(jié)果.培養(yǎng)基中金屬離子發(fā)生改變會使細(xì)菌表面化合物的空間構(gòu)型發(fā)生變化,造成其拉曼信號發(fā)生偏移[49～51],從而導(dǎo)致細(xì)菌的直接拉曼檢測結(jié)果重復(fù)率低、 應(yīng)用范圍較窄.

新型SERS基底的開發(fā)是增強拉曼信號的主要手段,通過優(yōu)化細(xì)菌拉曼檢測的基底,使之在拉曼激發(fā)波段內(nèi)樣品表面附近的電磁場增強,從而使細(xì)菌表面分子的拉曼散射信號顯著增強.常用的方法是在細(xì)菌外表面沉積納米金/銀膠體顆粒,從而產(chǎn)生SERS增強信號[52](圖5).Christian等[53]發(fā)現(xiàn),幾種與外傷感染相關(guān)的細(xì)菌細(xì)胞壁的表面生物結(jié)構(gòu)能夠引起單色光頻率變化.通常在水溶液環(huán)境中,親水的金黃色葡萄球菌和鮑曼不動桿菌很容易測得穩(wěn)定的拉曼光譜.而對于疏水性的綠膿假單胞菌、 肺炎克雷伯菌和大腸桿菌則需要通過比較拉曼峰的強弱進(jìn)行分類鑒別.

Fig.5 Schematic display of different approaches for SERS based detection of bacteria Whole cells can be measured on a solid substrate(A) or in a colloid suspension(B) and it is also possible to attach or deposit metallic nanoparticles directly on the bacterial cell wall(C) or to apply with SERS tags(D)[52]Copyright 2015,Elsevier.

由于磁性基底具有樣品富集功能,其與拉曼增強基底結(jié)合,在痕量檢測方面獲得了廣泛關(guān)注.如Silva等[54]制備了多功能的電磁等離子體Fe3O4-Au核殼納米粒子,通過施加外部磁場,在快速濃縮細(xì)菌樣本的同時顯著增強了細(xì)菌表面拉曼信號,提高了細(xì)菌檢測的靈敏度.該技術(shù)使用3 g/mL的Au-MNPs探針可在5 min內(nèi)實現(xiàn)對10 μL 105 cfu/mL細(xì)菌樣本的捕獲.Wang等[55]提出了電化學(xué)表面增強拉曼光譜(EC-SERS)技術(shù),將金納米粒子沉積到ITO電極表面,在電場驅(qū)動下細(xì)菌可聚焦到電極附近,使其拉曼信號被金納米粒子增強.通過對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行多種抗生素刺激,實現(xiàn)了2種細(xì)菌的藥敏檢測(圖6).

Fig.6 Schematics of the condensation process of Au-MNPs and bacteria(left) and the biomolecular characteristics of the bacterial cell wall that can possibly be detected by SERS(right)(A)[54] and schematic illustration for bacteria detection by using nanostructured Au based biosensor(B)[55] (A) Copyright 2019,Elsevier; (B) Copyright 2014,American Chemical Society.

3.2 拉曼光譜檢測細(xì)菌特異性代謝物

細(xì)菌的代謝方式繁多,根據(jù)其營養(yǎng)方式可分為自養(yǎng)型和異養(yǎng)型.部分細(xì)菌只需要二氧化碳作為它們的碳源,或者通過光合作用獲取能量,被稱作自養(yǎng)生物; 其它細(xì)菌依賴于氧化有機物獲取能量,稱為化能自養(yǎng)生物[56,57].不同的細(xì)菌擁有不同的酶系統(tǒng),在生長過程中對營養(yǎng)物質(zhì)的需求和代謝廢物存在差異,將這些不同化合物的生物化學(xué)差異作為細(xì)菌鑒別的依據(jù),為細(xì)菌鑒別和檢測開辟了一條新途徑.細(xì)菌的糖代謝過程是先將多糖降解成單糖進(jìn)而氧化為丙酮酸,而丙酸酮分解則因菌而異.如,大腸埃希氏菌先將丙酮酸降解成甲酸,進(jìn)而在甲酸解氫酶作用下分解成CO2和H2,而傷寒桿菌只能將丙酮酸轉(zhuǎn)化為甲酸[58,59].完整的蛋白質(zhì)不能直接被菌體吸收,必須先由細(xì)菌的胞外酶把蛋白質(zhì)分解成多肽或氨基酸,才能運轉(zhuǎn)通過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入菌細(xì)胞內(nèi)被利用.細(xì)菌分解蛋白質(zhì)可分為5個階段: 蛋白質(zhì)、 蛋白、 蛋白胨、 多肽和氨基酸.不同細(xì)菌降解蛋白質(zhì)的方式不同,可生成吲哚、 硫化氫和尿素等[60～63].利用細(xì)菌在營養(yǎng)需求和代謝廢物方面的差異,可間接進(jìn)行細(xì)菌鑒別.無標(biāo)記的細(xì)菌特異性代謝產(chǎn)物檢測是最理想的細(xì)菌鑒別手段,但受限于被檢測菌能否產(chǎn)生特異性的代謝產(chǎn)物.Bell等[64]將細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物二甲基二硫化合物(Dimethyl disulfide,DMDS)作為細(xì)菌活性的衡量指標(biāo),先將Au納米薄膜固定在細(xì)菌培養(yǎng)皿內(nèi)蓋上,當(dāng)DMDS吸附到Au納米膜表面即可產(chǎn)生SERS信號,整個過程可以在15 min內(nèi)完成,真正意義上實現(xiàn)了耐藥細(xì)菌的快速藥敏檢測.Bodelón等[65]將銅綠假單胞桿菌特異性分泌的綠膿素作為檢測指標(biāo),構(gòu)建全新的Au@pNIPAM SERS增強基底,實現(xiàn)了對耐藥銅綠假單胞桿菌種群生物膜之間信息傳遞機制的研究(圖7).

Fig.7 SERS spectra of the headspace(A)[64] and Raman and SERS spectra of pyocyainn(B)[65] (A) Copyright 2018,John Wiley and Sons Ltd.; (B) Copyright 2016,Springer Nature.

利用同位素標(biāo)記待測細(xì)菌是目前進(jìn)行代謝物檢測的主要方式.Cui等[66]將大腸桿菌對重水的攝取能力作為衡量大腸桿菌活力的指標(biāo),只需測定碳氘鍵(C—D)的拉曼譜峰就能監(jiān)測7種纖維素降解菌對羥甲基纖維素的代謝反應(yīng).另外,將固氮細(xì)菌通過15N2培養(yǎng)基培養(yǎng),能夠得到明顯差異的14N2和15N2共振拉曼光譜,其成像結(jié)果表明固氮菌存在明顯的異質(zhì)性[67].在細(xì)菌耐藥性檢測方面,發(fā)展了利用重水標(biāo)記的單細(xì)胞拉曼光譜檢測技術(shù),作為一種快速AST實驗可直接適用于臨床尿樣檢測.從接受尿液到拿到敏感/耐藥(Sensitivity/resistance,S/R)讀數(shù)的總時間縮短到2.5 h,克服了微生物活性檢測與微生物生長緩慢的矛盾,并根據(jù)相對C-D比值建立了一個新的S/R臨界值.這項工作提高了拉曼光譜檢測細(xì)菌耐藥性的臨床實用性和準(zhǔn)確性[68](圖8).

Fig.8 Probing and Raman imaging of N2-fixing bacteria in artfcial communities(A)[67] and flow chart of rapid Raman drug sensitivity test based on heavy water labeling(B)[68] (A) Copyright 2018,American Chemical Society; (B) Copyright 2019,American Chemical Society.

Huang等[69]將單細(xì)胞拉曼顯微光譜與氘同位素探測(Raman-Deuterium isotope detection)相結(jié)合,以氘代萘作為唯一碳源,運用激光共聚焦拉曼光譜對耐藥銅綠假單胞菌進(jìn)行半定量分析并揭示了苯丙氨酸在耐藥銅綠假單胞菌中的代謝過程.Cheng等[70]利用高光譜受激拉曼散射(Stimulated Raman scattering,SRS)成像技術(shù)在單細(xì)胞水平上監(jiān)測活菌對藥物的敏感性,該研究以萬古霉素敏感和耐藥腸球菌為模型,將細(xì)菌對氘化葡萄糖的攝取能力作為細(xì)菌活力指標(biāo),在無需培養(yǎng)的情況下實現(xiàn)了細(xì)菌對藥物的敏感性檢測(圖9).

Fig.9 Time lapse of C-D component concentration map in bacteria cultivated in glucose-d7 medium C-D component concentration map in VSE(A) and VRE(B),in the presence and absence of 20 μg/mL vancomycin[70].Copyright 2018,American Chemical Society.

3.3 基于標(biāo)記型拉曼探針的細(xì)菌檢測

無標(biāo)記的SERS活性納米粒子可以直接增強細(xì)菌本身的拉曼指紋譜圖,但在實際檢測環(huán)境(如尿液、 血液或污水)中選擇性較差,同時缺少標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌拉曼指紋光譜數(shù)據(jù)庫,嚴(yán)重限制了拉曼光譜在細(xì)菌檢測領(lǐng)域的應(yīng)用.將拉曼探針靶向細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞外膜,對待測菌進(jìn)行標(biāo)記是現(xiàn)階段拉曼光譜檢測細(xì)菌的主要手段.與傳統(tǒng)非標(biāo)記探針相比,標(biāo)記型 SERS探針有如下優(yōu)點: 靈敏度高,可對痕量物質(zhì)進(jìn)行分析檢測; 無光漂白,可對被標(biāo)記的細(xì)菌進(jìn)行實時監(jiān)測以研究更深層的生物學(xué)現(xiàn)象; 可設(shè)計并制備拉曼沉默區(qū)探針,提高檢測信號的信噪比[71,72](圖10).因此,在復(fù)雜介質(zhì)中,為了提高選擇性和檢測限,關(guān)鍵在于發(fā)展專一性和高性能的探針.典型的SERS探針由3部分組成: SERS基底(如AuNPs[73],AgNPs[74]和Au-AgNPs[75]等)、 拉曼報告分子和識別分子.由于金屬納米顆粒暴露的表面很容易結(jié)合生物基質(zhì)中的其它干擾分子,造成不穩(wěn)定的SERS信號,故將各種保護(hù)涂層包裹到貴金屬納米顆粒表面,以提高SERS信號的穩(wěn)定性.目前使用的保護(hù)劑包括聚合物、 脂質(zhì)體和無機硅層等[76,77].

Fig.10 Schematic illustration of label based and label-free based SERS method for bacteria detection[73] Copyright 2017,Elsevier.

標(biāo)記型SERS探針的信號來源于拉曼報告分子,通常使用含硫或含氮的有機染料分子,其對Ag和Au基底具有很高的親和力,能夠保證拉曼探針的穩(wěn)定性.目前,4-巰基苯甲酸(4-MBA)[78]、 4-氨基硫酚(4-ATP)[79]、 羅丹明6G(Rh6G)[80]、 4-巰基吡啶(4-MPY)[81]和5,5-二硫雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)[82]已成功應(yīng)用到基于SERS的細(xì)菌檢測中.特別是在拉曼探針中引入拉曼沉默區(qū)報告分子,能夠提高檢測結(jié)果的信噪比,提高對炔基、 氰基染料[83]的檢測靈敏度.

SERS探針的特異性取決于識別分子能否特異性靶向被檢測物,是拉曼檢測準(zhǔn)確性和靈敏度的重要保障.Nguyen等[84]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞桿菌可排放特異性的鐵載體(Pyoverdine,Pvd),用來富集周圍環(huán)境中的鐵離子,細(xì)菌通過細(xì)胞壁上特異性Pvd受體識別并將負(fù)載鐵離子的Pvd轉(zhuǎn)運到細(xì)胞中.利用該策略將特異性Pvd固定在鋁箔上,對不同的銅綠假單胞桿菌進(jìn)行捕獲后,直接進(jìn)行拉曼檢測.結(jié)果表明,對耐藥銅綠假單胞桿菌的檢測成功率高達(dá)90.7%,檢測限為5×103cfu/mL(圖11).

Fig.11 Structure of the pyoverdine iron complex of P. fluorescens DSM 50090(A),scheme illustrating the proposed isolation strategy for Pseudomonas spp.(B) and Raman detection of P. fluorescens and P. aeruginosa(C)[84] (B) The (3-glycidyloxypropyl)-trimethoxysilane modified surface(Ⅰ) is functionalized with an pyoverdine iron complex(Ⅱ),subsequently the chip can be used for capturing various Pseudomonas species(Ⅲ).Copyright 2016,American Chemical Society.

Wang等[85]設(shè)計了用于檢測致病菌的雙識別生物傳感器,在金納米粒子表面結(jié)合萬古霉素和核酸適配體對致病菌進(jìn)行雙重識別,顯著提高了探針對細(xì)菌的捕獲率; 同時與Fe3O4磁性納米材料結(jié)合,最低可捕獲3 cfu/mL濃度的細(xì)菌(圖12).

Fig.12 Schematic illustration of the synthesis of Au-Van SERS tags(A),the synthesis of aptamer-modified Fe3O4@AuMNPs(B),and the operating procedure for S. aureus detection via the dual-recognition SERS biosensor(C)[85]Copyright 2019,Elsevier.

Wang等[86]開發(fā)了一種Au包覆磁性納米粒子的新型拉曼基底,將MnFe2O4納米顆粒在超聲作用下均勻組裝到聚乙烯亞胺層上,再通過靜電作用吸附金納米顆粒形成金納米殼,該結(jié)構(gòu)具有極強的SERS活性和強磁響應(yīng)性,將金黃色葡萄球菌抗體負(fù)載到納米結(jié)構(gòu)表面,可用于細(xì)菌的捕獲和檢測.在激發(fā)光(波長785 nm)照射下,1330 cm-1處會產(chǎn)生極強的拉曼信號,從而實現(xiàn)對低濃度細(xì)菌的檢測,檢測限可達(dá)10 cfu/mL.

Petti等[87]設(shè)計了一種基于多層八極納米結(jié)構(gòu)的細(xì)菌拉曼傳感器,以噬菌體作為細(xì)菌識別分子,具有極高的拉曼增強效果,并顯著提高了檢測的特異性,實現(xiàn)了在1 h之內(nèi)對單個細(xì)菌的檢測(圖13).

Fig.13 Phage specifically recognizes the bacteria and then immobilizes the bacteria to the surface of a nano substrate with SERS activity,able to get extremely strong Raman signals[87]Copyright 2017,American Chemical Society.

將以上3種方式進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn),直接檢測細(xì)菌表面特有的報告分子,無需樣品前處理即可快速獲得檢測報告,但目前掌握的特異性報告分子較少,無法達(dá)到大量樣本準(zhǔn)確檢測的需求.細(xì)菌自身拉曼光譜信號弱,且存在明顯的異質(zhì)性,導(dǎo)致檢測重現(xiàn)性不佳、 靈敏度較低,嚴(yán)重限制了其應(yīng)用.檢測細(xì)菌代謝產(chǎn)物或代謝途徑是鑒別細(xì)菌活力、 實時監(jiān)測細(xì)菌生理狀態(tài)的有效方法,利用拉曼檢測無損的優(yōu)勢,可監(jiān)測細(xì)菌對外源物質(zhì)的響應(yīng),揭示特定的生理學(xué)過程,是一項非常有潛力的檢測技術(shù).利用細(xì)菌的異質(zhì)性可以研究種群中單個細(xì)菌的分工和信息傳遞,從而發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)現(xiàn)象.利用具有靶向性的標(biāo)記探針進(jìn)行細(xì)菌檢測,能顯著提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性,而其與貴金屬納米粒子結(jié)合則可大幅增強拉曼信號,以至于實現(xiàn)單細(xì)菌檢測[88].但由于探針的加入導(dǎo)致操作復(fù)雜,同時可能會影響細(xì)菌的正常生理狀態(tài),仍難以大范圍應(yīng)用和推廣.

4 總結(jié)與展望

準(zhǔn)確、 快速的細(xì)菌鑒定和藥敏測試技術(shù)對細(xì)菌耐藥性相關(guān)的基礎(chǔ)研究和臨床抗菌治療至關(guān)重要.近年來,細(xì)菌檢測技術(shù)取得了長足進(jìn)步,但檢測耗時長的缺陷仍未得到有效解決,嚴(yán)重影響對患者的診斷和治療.鑒于此,可考慮從以下幾個方面發(fā)展快速、 高效的拉曼光譜細(xì)菌檢測方法: (1) 利用拉曼光譜技術(shù)具備的無需細(xì)菌培養(yǎng)、 痕量檢測的優(yōu)勢,可大力開發(fā)特異性強、 SERS活性高的拉曼探針; (2) 在SERS探針中引入氰基、 炔基等拉曼沉默區(qū)信號,提高檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度; (3) 發(fā)展無標(biāo)記、 可激活響應(yīng)型拉曼探針,無需擔(dān)心光漂白,實時監(jiān)測細(xì)菌生理生化過程,研究細(xì)菌侵染、 耐藥等生理現(xiàn)象,從而為細(xì)菌治療提供新思路; (4) 發(fā)展便攜式拉曼檢測儀,并結(jié)合快速診斷技術(shù)(如試紙條、 微流控等),用于細(xì)菌的現(xiàn)場快速檢測; (5) 著力于細(xì)菌耐藥現(xiàn)狀,開發(fā)高靈敏耐藥菌檢測技術(shù)以及快速藥敏測試新策略.