大黃素在石墨烯/碳納米管復(fù)合修飾電極上的電化學(xué)行為

劉夢琴，向亨芳，曾榮英

(衡陽師范學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，功能金屬有機材料湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421008)

石墨烯是由碳原子組成的六方晶格材料，具有電催化活性高和電子轉(zhuǎn)移速率快等優(yōu)異的電化學(xué)特性，還具有良好的導(dǎo)熱性和巨大的比表面積[1-4]。碳納米管易于吸附和摻雜，能加速物質(zhì)的電子傳遞，已被廣泛應(yīng)用分析化學(xué)中，包括電化學(xué)傳感器和生物傳感器[5-7]。大黃素(1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌)是從中藥虎杖中分離得到的有效成分，在中國傳統(tǒng)上用于治療皮膚燒傷、膽石、肝炎、炎癥和骨髓炎[8]，還廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)上，其有抗腫瘤、抗癌活性，是一種三環(huán)共處同一平面的共軛體系，可以嵌入DNA中持續(xù)抑制DNA，實現(xiàn)誘導(dǎo)凋亡、抑制癌細胞遷移和增值功能，達到抑制腫瘤細胞生長的效果[9]，還有較好的抑菌能力，應(yīng)用于多種藥物中。近年來，它顯示出優(yōu)越的性能，作為一種新的治療藥物，以減少白血病的影響[10-11]。目前，大黃素的測定方法主要有高效液相色譜法[12-13]、薄層掃描法[14-15]、分光光度法[16]、毛細管電泳法[17]、電化學(xué)法[18]等。電化學(xué)方法具有操作簡單、靈敏度高、實驗成本較低等優(yōu)點，本工作基于石墨烯和碳納米管導(dǎo)電性強、比表面積大的特點，制備了石墨烯/碳納米管復(fù)合材料，提高了石墨烯的有效比表面積，研究了大黃素在石墨烯/碳納米管復(fù)合修飾電極(GR/MWCNTs/GCE)上的電化學(xué)行為，建立了一種測定大黃素的新方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

TECNAIG2F20S-TWIN透射電鏡(FEI香港有限公司)；CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華有限公司)；SB52000超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；pHS-3C酸度計(上海鵬順科學(xué)儀器有限公司)；三電極系統(tǒng)：GR/MWCNTs/GCE(自制)為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對電極。

大黃素(AR，上海金穗生物科技有限公司)；石墨粉(AR，阿拉丁試劑廠)；多壁碳納米管(AR，北京博宇高科新材料技術(shù)有限公司)。

1×10-3mol·L-1大黃素儲備液：準(zhǔn)確稱量0.006 8 g大黃素固體，用無水乙醇定容到25.00 mL容量瓶中，置入棕色瓶中并置于冰箱中保存。其它試劑均為分析純，所用水為二次蒸餾水。

1.2 氧化石墨烯的制備

采用改良的Hummers法[19-20]制備氧化石墨烯。用量筒量取23 mL濃硫酸，冰浴降溫至0℃。將0.5 g石墨粉和0.5 g NaNO3加入濃硫酸中，機械攪拌下緩慢加入3 g KMnO4(此時溫度控制在5℃以下)，可觀察到瓶壁出現(xiàn)綠色。將溫度升到35℃，機械攪拌2 h，變成糊狀物?？刂茰囟?0℃以下，緩慢加入40 mL蒸餾水。繼續(xù)升溫至95℃反應(yīng)半小時，加入100 mL蒸餾水。攪拌下，分數(shù)次倒入20 mL 30%的過氧化氫，得金黃色溶液，趁熱抽濾。先用150 mL體積比為1∶10的鹽酸溶液洗滌，再用150 mL蒸餾水洗滌，最后將濾餅置入50℃的恒溫干燥箱干燥6 h，得黃色的氧化石墨烯固體，取出，裝瓶備用。

1.3 GR/MWCNTs復(fù)合材料的制備

多壁碳納米管在濃硝酸中純化得到短的羧基化多壁碳納米管(MWCNTs)[21]。稱取0.5 g MWCNT加入200 mL 6.0 mol/L HNO3中，加熱回流6 h，蒸餾水洗至中性，得到短的羧基化多壁碳納米管(MWCNTs)，干燥成粉末備用。稱取0.037 5 g GO和0.012 5 g MWCNTs置于250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL去離子水超聲分散2 h，然后依次加入1 mL 35%水合肼、7 mL 28%氨水，并于95℃下水浴回流1 h，冷至室溫，抽濾，真空干燥，得到石墨烯/多壁碳納米管復(fù)合材料(GR/MWCNTs)[22]，并以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑將其制成2.5 mg/mL的分散液。

1.4 GR/MWCNTs/GCE修飾電極的制備

將玻碳電極用Al2O3粉末拋光打磨成鏡面，然后在超聲下依次用蒸餾水、無水乙醇、蒸餾水清洗3 min，自然晾干，備用。用微量注射器取3μL 2.5 mg/mL GR/MWCNTs復(fù)合材料溶液，滴至裸GCE上，紅外燈烘干，得到GR/MWCNTs/GCE修飾電極。

2 結(jié)果與討論

2.1 石墨烯及GR/MWCNTs復(fù)合材料的表征

取適量石墨烯溶液，滴到銅網(wǎng)上，烤干制樣，采用透射電鏡(TEM)對石墨烯樣品的微觀結(jié)構(gòu)進行表征。由透射電鏡圖1A可知，石墨烯呈現(xiàn)平面結(jié)構(gòu)，同時又有大量因石墨烯平面重疊而產(chǎn)生的褶皺，能增大比表面積及與溶液的接觸面積，增強其電化學(xué)性能。

將石墨烯和碳納米管復(fù)合后，通過透射電鏡圖1B可以明顯看出碳納米管交錯分布在石墨烯表面，因石墨烯在實際使用中易卷曲而導(dǎo)致表面積減小，碳納米管在石墨烯表面形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)將石墨烯平面結(jié)構(gòu)固定，使石墨烯實際表面積與理論值更加接近，同時石墨烯也是一種優(yōu)良的導(dǎo)電材料，通過復(fù)合，復(fù)合材料的導(dǎo)電性顯著增大。

圖1 透射電鏡圖Fig.1 TEM image A-TEM image of GO;B-TEM image of GR/MWCNTs

2.2 GR/MWCNTs/GCE在大黃素/PB體系中的循環(huán)伏安行為

將GCE、GR/GCE、MWCNTs/GCE、GR/MWCNTs/GCE電極置于10 mL大黃素溶液(1 mL1.0×10-4mol/L的大黃素+2 mL pH=5.00混合磷酸鹽(PB)緩沖液+7 mL水)進行循環(huán)伏安掃描。由圖2可知，大黃素均有一對氧化還原峰，氧化峰在-0.10 V左右，還原峰在-0.65 V左右，在不同的修飾電極下，還原峰電位出現(xiàn)負移，峰電位與峰電流分別為Ep1=-0.558 V，Ip1=8.974μA，Ep2=-0.584 V，Ip2=12.58μA，Ep3=-0.662 V，Ip3=13.00μA，Ep4=-0.616 V，Ip4=32.30μA。復(fù)合修飾電極的峰電位與裸電極相比負移0.058 V，復(fù)合修飾電極的峰電流是裸電極的3.6倍，說明GR/MWCNTs復(fù)合修飾電極具有優(yōu)異的電催化性能和富集效應(yīng)。

圖2循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms Cyclic voltammogram solution:1.00×10-5mol/L Emodin/PB(p H=5.00)；Potential scanning range:-0.8~0V;Scanning rate:100m V/s;1-GCE,2-MWCNTs/GCE,3-GR/GCE,4-GR/MWCNTs/GCE

2.3 測定條件優(yōu)化

2.3.1 GR/MWCNTs用量的選擇

在pH=5.00的PB緩沖溶液中，用GR/MWCNTs/GCE測定1.00×10-5mol/L大黃素。結(jié)果表明，隨著修飾劑用量的增加，用量為3μL時峰電流最大，本實驗選用最佳修飾劑用量為3μL。

圖3 GR/MWCNTs復(fù)合材料的用量Fig.3 Influence of GR/MWCNTs dosage Cyclic voltammogram solution:1.00×10-5mol/L Emodin/PB(p H=5.00)；Potential scanning range:-0.8~0V;Scanning rate:100mV/s

2.3.2 掃描速率的選擇與轉(zhuǎn)移電子數(shù)

研究了不同掃描速率下1.00×10-5mol/L大黃素在電極上的循環(huán)伏安行為，試驗表明，在100~500 mV/s范圍內(nèi)，峰電流隨著掃描速率的增大而增大，峰電流Ip(μA)與掃描速率v呈線性關(guān)系(插圖A)，線性方程為Ip=38.3v+3.204,r=0.980 1，說明此條件下電極反應(yīng)過程主要是受吸附控制。當(dāng)掃描速度過大時，峰形變寬，充電電流過大，不利于大黃素的測定。故本實驗選擇掃描速度為100 mV·s-1。

在峰電位-掃描速率對數(shù)值圖中(插圖B)，峰電位與掃描速率對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Ep(V)=0.034 5 lnν(V/s)+0.667，r=0.991 8。根據(jù)公式Ep=RT ln v/2βnF+k，線性圖的斜率應(yīng)為RT/2βnF。取β=0.6[23]，T=298 K，根據(jù)該公式計算的電子數(shù)n=0.620 2≈1。

圖4 掃描速率的影響Fig.4 The CVs of 10μM Emodin at the GR/MWCNTs/GCE under different scan rates(a→e:100,200,300,400,500mV/s).Inset A is the plot of I p vs.ν;Inset B is the plot of E p vs.lnν

2.3.3 底液pH值的選擇與轉(zhuǎn)移質(zhì)子數(shù)

試驗了不同p H值的PB緩沖液對峰電流(圖5A)和對峰電位(圖5B)的影響，結(jié)果表明在1.00×10-5mol/L大黃素中，隨著底液pH的增加，Ip先增大后減小，在pH=5.00時Ip達到峰值，因此選擇pH=5.00的PB緩沖溶液。

分析峰電位-pH相關(guān)趨勢，結(jié)果表明，峰電位與pH呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖5B)，線性方程為Ep(mV)=1065.3-54.7pH，r=0.993 9，根據(jù)Ep(mV)=K-59pH，說明反應(yīng)過程中有H+參與，并且質(zhì)子轉(zhuǎn)移數(shù)a與電子數(shù)n相同，即a=n=1，說明大黃素在電極中的反應(yīng)過程有1個電子和1個質(zhì)子參與，推測其可能的反應(yīng)機理為:

圖5 p H對大黃素峰電流(A)與峰電位(B)的影響Fig.5 Influence of p H on the reduction peak current(A)and peak potential(B)of emodin.

2.3.4 初始電位的影響

采用線性伏安掃描(LSV)分別試驗了初始電位為-0.4，-0.3，-0.2，-0.1，0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 V對峰電流的影響。結(jié)果表明，初始電位為0V時，峰值電流最大，試驗選用0~-0.8 V的掃描范圍。

圖6 初始電位的影響Fig.6 Influence of Initial potential on the reduction peak current

2.3.5 富集電位的影響

采用差分脈沖溶出伏安法(DPSV)分別考察了富集電位為-0.6，-0.5，-0.4，-0.3，-0.2，-0.1，0 V對大黃素測定的影響。結(jié)果表明，當(dāng)富集電位為-0.2 V時效果最好，峰電流最大，因此選定富集電位為-0.2 V。

圖7 富集電位的影響Fig.7 Influence of enrichment potential on the reduction peak current

2.3.6 富集時間的影響

采用差分脈沖溶出伏安法(DPSV)考察了在最佳富集電位下富集時間對測定的影響，分別測定富集時間為50，100，150，200，250，300，350 s，結(jié)果表明，在富集時間為250 s時測定結(jié)果最佳。?

圖8 富集時間的影響Fig.8 Influence of enrichment time on the reduction peak cur r ent

2.4 電極的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

用GR/MWCNTs/GCE電極在最佳實驗條件下測定1.00×10-5mol/L大黃素，重復(fù)測定6次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.64%，說明該修飾電極重現(xiàn)性良好。

將新制備GR/MWCNTs/GCE修飾電極置于4℃冰箱中保存，每隔一天重復(fù)測定一次，連續(xù)測定5次，其氧化峰電流的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.85%，說明此電極的穩(wěn)定性較好。

表1 電極重現(xiàn)性實驗Table.1 Repr oducibility of GR/MWCNTs/GCE

圖9 電極穩(wěn)定性實驗Fig.9 Stability of GR/MWCNTs/GCE

2.5 干擾實驗

在最佳實驗條件下，考察了常見無機離子與有機物對1.010-5mol/L大黃素測定的影響。實驗表明，在允許相對誤差±5%范圍內(nèi)，100倍的K+、Na+、NH4+、Cl-、SO42-、NO3-，30倍的維生素B1、抗壞血酸(AA)、多巴胺(DA)，10倍的白楊素等對大黃素測定均無干擾，說明該GR/MWCNTs/GCE修飾電極選擇性較好，抗干擾能力較強。

2.6 線性關(guān)系與檢出限

在最佳實驗條件下，采用DPSV進行測定，大黃素還原峰電流與其濃度在1×10-8~1×10-5mol/L內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為Ip(μA)=1.1285c(μmol/L)+4.7699，r=0.992 9，檢出限(S/N=3)為1.1×10-9mol/L。

圖10 不同濃度大黃素的差分脈沖伏安圖；內(nèi)插圖表示Ip與大黃素濃度的關(guān)系Fig.10 DPSV of Emodin for the different concentration at GR/MWCNTs/GCE;Inset is the plot of Ip vs.CEmodin.Testing potential:0~-0.8V;scanning rate:100 mV/s;rest time：4s;Enrichment potential:-0.2V;Enrichment time:250s

2.7 樣品及回收率測定

準(zhǔn)確稱取大黃粗粉10 g于250 mL圓底燒瓶中，加30 mL無水乙醇，沸水浴中回流2 h，趁熱過濾，濾液靜置2 h，抽濾得沉淀，將沉淀提取物用乙酸乙酯溶解，用5%Na2CO3溶液萃取數(shù)次，合并萃取液，加10%鹽酸至酸性得橙黃色沉淀，用冰乙酸重結(jié)晶，得到大黃素純化品。

準(zhǔn)確稱取大黃素純化品0.01~0.02 g，置100 mL容量瓶中，加乙醇溶解，定量搖勻。移取一定量的樣品溶液分別置于100 mL容量瓶中，分別加入大黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0×10-4mol/L)1，2，4，5 mL。按實驗方法進行加標(biāo)回收率實驗，測定結(jié)果列于表2，大黃素素的回收率為96.0~103.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.7~3.5%。

表2 樣品分析結(jié)果及回收率Table.2 Determination results of emodin in samples and recover ies

3 結(jié)論

本實驗以GR和MWCNTs為修飾劑，制備GR/MWCNTs/GCE復(fù)合修飾電極。在最佳實驗條件下(緩沖液pH=5.00，掃描速率100 mV/s，富集時間250 s)，GR/MWCNTs/GCE復(fù)合修飾電極對大黃素有良好的電催化能力，電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，還原峰電流與大黃素濃度為1×10-8~1×10-5mol/L時有良好的線性關(guān)系，檢出限(S/N=3)為1.1×10-9mol/L。該法的靈敏度高，操作方便、快速，復(fù)合材料性能穩(wěn)定。測定大黃藥材中的大黃素回收率為96.0~103.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.7~3.5%，為大黃素的痕量分析提供了一種新方法。