石榴果腐病病原的分離鑒定

暢引東，賈 俊，解宇潔，李榮榮，史錦淑，陳 興，王建明

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.晉中市規(guī)劃和自然資源局，山西晉中030600；3.太原師范學(xué)院，山西太原030619）

石榴（Punica granatum L.）為落葉喬木或灌木，在我國(guó)已有2 000 多年的栽培歷史[1]。山西省晉南地區(qū)氣候溫和，日照充足，土層深厚，適合石榴的生長(zhǎng)。該地區(qū)自古以來(lái)就有種植石榴的習(xí)俗，既有家庭院落栽培，也有集中成片種植[2]，現(xiàn)今僅運(yùn)城臨猗縣年產(chǎn)石榴就可達(dá)4.5 萬(wàn)t[3]。近年來(lái)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對(duì)健康生活有了更高的追求。石榴果實(shí)因其含有豐富的天然活性物質(zhì)，具有抗衰老、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和減緩癌變進(jìn)程等作用[4-5]，越來(lái)越受到大眾的青睞。市場(chǎng)需求的增大、政府“一村一品、一縣一業(yè)”政策的實(shí)施，以及當(dāng)?shù)厥穹N植傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)等都極大地促進(jìn)了當(dāng)?shù)厥癞a(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

隨著石榴種植規(guī)模的擴(kuò)大，地區(qū)間品種調(diào)用、產(chǎn)業(yè)升級(jí)等對(duì)石榴果園的管理提出更高的要求。石榴在生長(zhǎng)和貯藏過(guò)程中極易遭受多種病原侵染，引起果樹樹勢(shì)減弱、果實(shí)腐爛和商品性下降等問(wèn)題。目前已發(fā)現(xiàn)的石榴病害主要由病原真菌侵染造成。截止目前，已報(bào)道的石榴病害的病原真菌主要有甘薯長(zhǎng)喙殼（Catalysts fimbriation Ellis et Halted）、疫霉菌（Phytophthora sp.）、厚盤單毛孢（Monochaetia pachyspora Bubak）、石榴尾孢霉（Cercospora punicae P. Henn.）、石榴生尾孢霉（Cercospora punicola）、煤炱菌（Capnodium sp.）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides（Penz.）Sacc.）、石榴墊殼孢（Coniella granati （Sacc.）Petr. & Syd）、柑 橘 葡 萄 座 腔 菌（Botryosphaeria rhodina（Berk.et Curt.）Shoemaker）、石榴擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis punicae）、石榴痂圓孢（Sphaceloma punicae Bitancourt et Jenkins）、黑曲霉（Aspergillus niger V. Tiegh.）、青霉菌（Penicillium sp.）等等，分別引發(fā)石榴枯萎?。楹Ωo）、石榴疫腐?。楹涓汕o基部）、石榴葉枯?。楹θ~片）、石榴褐斑?。楹θ~片和果實(shí)）、石榴黑斑?。楹θ~片和果實(shí)）、石榴霉污病（為害葉片和果實(shí)）、石榴炭疽?。楹麑?shí)，也可為害葉片和枝條）、石榴干腐病（為害果實(shí)和枝干）、石榴焦腐?。楹麑?shí)）、石榴蒂腐?。楹麑?shí)）、石榴瘡痂?。楹麑?shí)）、石榴曲霉?。楹麑?shí)）和青霉?。楹麑?shí)）等10 多種病害[6-12]。這些病害中多數(shù)是由一些常見(jiàn)病原真菌侵染引起，在我國(guó)各地多有發(fā)生，也有個(gè)別是在多地已有發(fā)生的檢疫性病害[6，8，10]。由此可見(jiàn)，加強(qiáng)對(duì)新病害的調(diào)查研究，對(duì)做好植物檢疫工作具有重要的理論和實(shí)踐意義。

近年，在山西省運(yùn)城市洪洞縣石榴果實(shí)上發(fā)現(xiàn)一種石榴病害。據(jù)農(nóng)戶描述，在最初僅發(fā)現(xiàn)有個(gè)別病果，后來(lái)幾乎在所有果實(shí)上都產(chǎn)生了類似病斑。此現(xiàn)象在往年已有發(fā)現(xiàn)，之后該病害年年出現(xiàn)，噴施藥劑防治效果欠佳。考慮到該石榴樹所處農(nóng)戶院落緊鄰石榴果園，其果實(shí)病狀與以往發(fā)現(xiàn)果實(shí)病狀有出入。因此，明確該病害的致病病原對(duì)該種病害的防治及當(dāng)?shù)厥窆麡I(yè)的健康發(fā)展具有積極的指導(dǎo)意義。

本研究對(duì)采集自山西省洪洞縣的石榴病果，運(yùn)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法明確引發(fā)該病害的致病病原，旨在為該病害的防治提供有效的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試石榴病果采集自山西洪洞縣。

1.2 試劑與儀器

試驗(yàn)中選用的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）、查氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基（Czapek Yeast Extract Agar，CYA）和燕麥瓊脂培養(yǎng)基（Oatmeal Agar，OA）[13]。

CTAB 緩沖液[14]、Taq PCR Mix 預(yù)混液、Green 核酸染色劑、1 倍TAE 電泳緩沖液、6 倍上樣緩沖液、DNA marker D（100～2 000 bp）和DNA Marker S（100～5 000 bp）（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

凈化工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），智能光照培養(yǎng)箱（GTOP-Y 系列，浙江托普儀器有限公司），OLYMPUS 光學(xué)顯微鏡（BX51，日本奧林巴斯），高壓蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-70A，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），熱空氣消毒箱（GR-240，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），電子天平（BSA224S，德國(guó)賽多利斯），數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2，常州國(guó)華電器有限公司），高速離心機(jī)（Thermo Sorvall ST 16RT，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司），PCR 儀（T100，伯樂(lè)（中國(guó)）有限公司），電泳儀（PowerPacTMBasic，伯樂(lè)（中國(guó)）有限公司），凝膠電泳成像分析儀Bio-Rad PCR 儀（Universal Hood ll，伯樂(lè)（中國(guó)）有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 病原菌的分離純化 采用組織分離法于果實(shí)表面病健交界處切取3～5 mm 的正方體組織，在75%的酒精溶液內(nèi)浸泡2～3 s，后用無(wú)菌水沖洗3 次，用滅菌濾紙吸干表面水分，移至PDA 平板上，在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，將組織上長(zhǎng)出的菌落轉(zhuǎn)接至新的PDA 平板進(jìn)行純培養(yǎng)，將分離菌株進(jìn)行單孢純化后轉(zhuǎn)入PDA 培養(yǎng)基作為菌種保存?zhèn)溆肹13]。病果內(nèi)部病原菌的分離可用滅菌小刀切開(kāi)石榴，挑取病果內(nèi)部患病組織，放在PDA 平板上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，隨后將分離菌株單孢純化后轉(zhuǎn)入PDA 培養(yǎng)基作為菌種保存?zhèn)溆肹13]。

1.3.2 菌株致病性測(cè)定 采用致傷接種法[13]，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用75%酒精對(duì)石榴果實(shí)進(jìn)行表面消毒，再用無(wú)菌水進(jìn)行沖洗，晾干后備用；將純化菌株制成濃度為1×106個(gè)/mL 的孢子懸浮液，采用針刺法接入健康石榴果實(shí)的中部，以無(wú)菌水接種作為空白對(duì)照，每個(gè)回接試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)；將回接的石榴果實(shí)放入塑料盒內(nèi)的培養(yǎng)皿上，用PE 保鮮膜封口，放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)皿與塑料盒之間的空隙處塞入無(wú)菌水浸濕的脫脂棉做保濕處理。隨后每天觀察果實(shí)的發(fā)病情況，并做記錄。

1.3.3 菌株形態(tài)學(xué)鑒定 將純化的菌株轉(zhuǎn)接到PDA 平板上，此后3～7 d 測(cè)量菌落直徑，在第4 天記錄氣生菌絲特性和培養(yǎng)物色澤，并在顯微鏡下觀察菌株的分生孢子的有無(wú)、數(shù)量、大小、形狀以及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等顯微形態(tài)特征，記錄并拍照；對(duì)在PDA 培養(yǎng)基上觀察不到孢子的菌株，則轉(zhuǎn)接至OA 培養(yǎng)基和CYA 培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其有無(wú)孢子或子實(shí)體產(chǎn)生，以及其產(chǎn)生所需的時(shí)間，并對(duì)菌落特征和顯微形態(tài)進(jìn)行拍照和記錄。最后參考《中國(guó)真菌志》和《真菌鑒定手冊(cè)》[15-16]進(jìn)行分類鑒定。

1.3.4 菌株分子鑒定 采用CTAB 法對(duì)菌株基因組DNA 進(jìn)行提取[14]。以供試菌株基因組DNA 為模板，選用真菌通用引物ITS1（5′- TCCGTAGGTGAA CCTGCG-3′）和ITS4（5′- TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′）對(duì)病原菌rDNA 的ITS 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。總反應(yīng)體系為20 μL，包括DNA 模板1 μL、Taq PCR Mix 預(yù)混液6 μL、ITS1 和ITS4 引物各1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)34 次；最后72 ℃再次延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在恒壓110 V 下用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將得到的序列在NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast 比對(duì)，獲得相似度高的核苷酸數(shù)據(jù)，利用MEGA 6 軟件對(duì)獲取的序列構(gòu)建鄰接樹進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴病害癥狀

山西省洪洞縣采集的石榴病果的病狀為果實(shí)外部表面具有規(guī)則的圓形輪紋狀病斑，邊緣處為白色暈圈，由邊緣至病斑中央色澤從黃褐色逐漸加深為棕褐色，輪紋中央為褐色至深褐色（圖1-A）。石榴病果實(shí)內(nèi)部已大部分褐化，自病果的萼筒處到果實(shí)內(nèi)部布滿黑褐色的霉層，且具有灰白色的菌絲。籽粒間松散，部分籽粒喪失水分，且上布滿黑色、白色的霉層（圖1-B）。采集的供試病果后期逐漸失水干枯，形成僵果。

2.2 菌株分離純化和致病性測(cè)定結(jié)果

從采集的石榴果實(shí)樣品中通過(guò)組織分離法和直接挑取分離法，共分離純化得到3 種特征各異的真菌菌株，分別編號(hào)為SLX、SLY 和SLZ。經(jīng)柯赫氏法則回接鑒定證明，3 種菌株接種后，菌株SLX 和菌株SLY 可以侵染石榴果實(shí)引起發(fā)病，而菌株SLZ則未能引起發(fā)?。▓D2）。從接種發(fā)病的果實(shí)上分離純化的病原菌與該分離菌株在形態(tài)上相同，因此，可確定該分離物是病原菌。

菌株回接4 d 時(shí)，菌株SLX 回接果實(shí)表面出現(xiàn)黃色病斑，菌株SLY 回接果實(shí)表面出現(xiàn)灰白色點(diǎn)狀霉層，菌株SLZ 回接果實(shí)表面與空白對(duì)照相同。在菌株回接4～7 d 時(shí)，菌株SLX 回接果實(shí)表面病斑逐漸向外擴(kuò)大，中央出現(xiàn)黑褐色輪紋且伴有白色菌絲，邊緣為淡黃色暈圈，從邊緣至病斑中央色澤從淡黃色逐漸加深為棕褐色，中央出現(xiàn)黑褐色輪紋且伴有灰白色菌絲（圖2-A）；菌株SLY 回接果實(shí)表面原先的灰白色點(diǎn)狀霉層逐漸變?yōu)楹谏箤?，黃褐色病斑逐漸擴(kuò)大（圖2-B）；菌株SLZ 回接后未能在石榴果實(shí)上侵染擴(kuò)展，僅有稍許菌絲匍匐生長(zhǎng)在果實(shí)表面（圖2-C），與空白對(duì)照果實(shí)表面相同，無(wú)明顯的病狀（圖2-D）。

2.3 菌株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

根據(jù)病原菌的菌落表面形態(tài)及顯微形態(tài)，參照《中國(guó)真菌志》及《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，菌株SLX 為石榴墊殼孢（Coniella granati（Sacc.）Petr. &Syd），屬半知菌亞門（Fungi Imperficti）殼霉目（Sphaeropsidales）殼霉科（Sphaeropsicaceae）。有性態(tài)為石榴小赤殼菌（Nectriella versoniana Sacc. et Penz），屬 子 囊 菌 綱（Ascomycetes） 肉 座 菌 目（Hypocreales）叢赤殼科（Nectriaceae）。菌株SLY 為黑曲霉（Aspergillus niger），屬半知菌綱殼霉目杯霉科（Discellaceae）。菌株SLZ 為黑附球菌（Epicoccum nigrum），屬半知菌綱殼霉目杯霉科。

2.3.1 石榴墊殼孢Coniella granati（Sacc.）Petr.&Syd（菌株SLX） 在PDA 培養(yǎng)基上菌絲為白色，呈輪紋狀向外擴(kuò)展，菌絲稀疏，每輪菌絲呈波浪狀。菌絲生長(zhǎng)速率為1.0～1.1 cm/d（圖3-A、B）。培養(yǎng)至7 d時(shí)已滿皿，發(fā)現(xiàn)無(wú)產(chǎn)孢后接入CYA 培養(yǎng)基，菌絲為白色，初期呈放射狀花朵形態(tài)向外展開(kāi)，生長(zhǎng)速率為1.2～1.3 cm/d（圖3-C、D）。第5～6 天中央出現(xiàn)黑色分生孢子器，裸生或半埋生于培養(yǎng)基中，逐漸向外擴(kuò)展，培養(yǎng)至第10～12 天時(shí)菌絲消失，黑色分生孢子器布滿整個(gè)培養(yǎng)基（圖3-E、F）。

在光學(xué)顯微鏡下觀察到分生孢子器呈鵝蛋型，黑褐色，大小為（115～140）μm×（90～135）μm（圖4-A、B）。產(chǎn)孢區(qū)有墊狀凸起，呈雪花狀的鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)，無(wú)色光滑（圖4-C）。分生孢子呈紡錘形，無(wú)色或淡褐色，無(wú)隔，表面光滑，大小為（9～13）μm×（3～4）μm（圖4-D）。

2.3.2 黑曲霉Aspergillus niger（菌株SLY） 在PDA培養(yǎng)基上初期為白色，菌絲致密無(wú)褶皺。2～3 d 后長(zhǎng)出黑色孢子，表面黑色絲絨狀，中心凸起，有放射狀溝紋，邊緣有白色氣生菌絲，粗糙（圖5-A）。生長(zhǎng)速率為0.4～0.5 mm/d，培養(yǎng)至7 d 時(shí)菌落直徑達(dá)到4 cm（圖5-B）。

在光學(xué)顯微鏡下觀察到分生孢子梗為（25～30）μm×（150～200）μm，頂端的分生孢子頭呈膨大球形頂囊，直徑180～230 μm，淡黑褐色，頂囊產(chǎn)孢區(qū)全面覆有產(chǎn)孢梗，雙層（圖6-A）。分生孢子球形，光滑，直徑為2.5～3.8 μm（圖6-B）。

2.3.3 黑附球菌Epicoccum nigrum（菌株SLZ） 初期菌絲為粉色偏白，5 ～6 d 后由內(nèi)向外顏色加深為橘粉色，后期中間菌絲呈環(huán)凸起，菌絲稠密，生長(zhǎng)速率為3～5 mm/d，培養(yǎng)至7 d 時(shí)菌落直徑達(dá)到3 cm（圖7-A、B）。培養(yǎng)至12 d 時(shí)發(fā)現(xiàn)無(wú)產(chǎn)孢，接入OA培養(yǎng)基，菌絲為白色、稀疏，呈放射狀平鋪延伸，生長(zhǎng)速率為6～7 mm/d，較PDA 生長(zhǎng)速率快。4～5 d 后從中央向外逐漸生成黑色顆粒（圖7-C、D），10～11 d時(shí)滿皿，菌株中央產(chǎn)生的黑色顆粒較多，向外逐漸減少（圖7-E）。

在光學(xué)顯微鏡下觀察到無(wú)色光滑的菌絲體，寬1～2 μm，多數(shù)分枝。淡褐色短粗的分生孢子梗（3～5）μm×（1～2）μm，有隔（1～2 個(gè)）或無(wú)隔（圖8-A）。分生孢子梗頂端膨大處生出球形分生孢子，初無(wú)色或淡褐色，后黃褐色、黑褐色，無(wú)隔。分生孢子表面粗糙，直徑大小為20～30 μm（圖8-B）。

2.4 菌株分子鑒定結(jié)果

以菌株SLX、SLY 和SLZ 的基因組DNA 為模板，用真菌通過(guò)引物ITS1/ITS4 對(duì)病原菌rDNA的ITS區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。經(jīng)測(cè)序分析，3 個(gè)菌株SLX、SLY和SLZ 的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為518、559、585 bp，將所得序列在GenBank 序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列比對(duì)，從中選取顯示明確屬種、一致性高、覆蓋率高（＞98%）的序列，以尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）為外群，利用MEGA 6 軟件進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果如圖9 所示。

由圖9 可知，3 個(gè)菌株通過(guò)聚類劃分為3 組，組間的相關(guān)性存在明顯差異。菌株SLX 與所選的石榴墊殼孢菌株（Coniella granati）的序列同源性達(dá)到99.82%以上；菌株SLY 與所選的黑曲霉（Aspergillus niger）菌株的序列同源性達(dá)到99.12%以上；菌株SLZ 與所選的黑附球菌（Epicoccum nigrum）菌株的序列同源性達(dá)到99.61%以上。通過(guò)ITS 序列分析可將菌株SLX、SLY 和SLZ 分別鑒定為Coniella granati、Aspergillus niger 和Epicoccum nigrum。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)手段和致病性試驗(yàn)對(duì)引起山西省洪洞縣石榴果腐病的病原進(jìn)行了鑒定，明確引起果實(shí)腐爛的病原為石榴墊殼孢（Coniella granati）和黑曲霉（Aspergillus niger）。

據(jù)報(bào)道，石榴墊殼孢可在石榴生長(zhǎng)期及貯藏期均可對(duì)石榴果實(shí)進(jìn)行侵染。該病原易從萼筒處侵入。發(fā)病初期果實(shí)表面形成褐色病斑，中期病斑邊緣產(chǎn)生黃色暈圈，后期果實(shí)失水皺縮，籽粒松散，成僵果狀[18]。這與本試驗(yàn)中觀察到的癥狀基本一致。黑曲霉對(duì)石榴果實(shí)的侵染則多發(fā)現(xiàn)于儲(chǔ)藏期，易從傷口處侵入。初期果實(shí)表面形成黑色病斑，中期病斑擴(kuò)大，并伴有黑色霉層，后期果實(shí)發(fā)生軟腐，肉眼可見(jiàn)到黑色的子實(shí)體[19]。本試驗(yàn)從田間的發(fā)病幼果中分離出黑曲霉，表明黑曲霉在石榴生長(zhǎng)期也可侵入寄主潛伏，在環(huán)境適宜時(shí)即可侵染發(fā)病。

值得注意的是，在病原菌的致病性試驗(yàn)中，2 種病原的致病癥狀與試驗(yàn)最初采集的病果上的癥狀不一致，在回接果實(shí)發(fā)病期間并未出現(xiàn)與供試病果一致的規(guī)則的圓形輪紋狀病斑，但與文獻(xiàn)報(bào)道的癥狀相一致[20]。這可能是由于接菌方式與原先病果受侵染的方式不同造成，也可能是由于其癥狀是由石榴墊殼孢和黑曲霉共同作用所導(dǎo)致的結(jié)果，其具體發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

石榴墊殼孢和黑曲霉病原引起病害的防治已有多種成熟的手段。對(duì)于石榴墊殼孢引起病害的防治，可在越冬期間鏟除干枯的枝條及枝條上的老化翹皮，清除果園內(nèi)的僵果，防止石榴墊殼孢對(duì)次年石榴果實(shí)進(jìn)行再侵染；花期結(jié)束后噴施氟硅唑、腈菌唑，可有效減少石榴干腐病的發(fā)生[21]。對(duì)于黑曲霉引發(fā)病害的防治，可在果實(shí)成熟期中進(jìn)行適當(dāng)?shù)耐L(fēng)散濕，雨后及時(shí)排水，可有效減少曲霉病的發(fā)生；在發(fā)病初期使用多菌靈或加瑞農(nóng)能夠有效防止黑曲霉繼續(xù)侵染[22]。此外，通過(guò)對(duì)石榴果實(shí)進(jìn)行套袋處理和除去花蕊，能有效減少病原菌的侵染，也可在果園中推廣使用。