9 種植物提取物對(duì)三七根腐病病原菌的抑菌活性測(cè)定

何曉婷，王均慧，李 嬌，魏倩倩，馮 雪，曹 揮

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

三七（Panax notoginseng）又名田七、金不換，屬五加科（Araliaceae）人參屬（Panaxlinn）多年生陰性草本植物，是一種傳統(tǒng)的中草藥[1-2]，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及藥用價(jià)值，現(xiàn)已成為云南、廣西、福建等地的支柱型產(chǎn)業(yè)[3-4]，主要采取人工栽培和集約化的種植方式。由于長(zhǎng)期大面積的單一種植，加之三七喜陰暖潮濕[5]，使得三七病害發(fā)生嚴(yán)重，特別是根腐病[6]，是三七生產(chǎn)中毀滅性的病害，嚴(yán)重影響三七種植業(yè)的發(fā)展。

三七根腐病致病因子復(fù)雜，其發(fā)生與病原菌、生長(zhǎng)環(huán)境、施肥、灌水量適宜與否等都有重要的聯(lián)系，致使防治工作極難展開(kāi)。植物保護(hù)工作者根據(jù)多年的工作經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，在防治根腐病時(shí)要靈活運(yùn)用“預(yù)防為主，綜合防治”的措施，如農(nóng)業(yè)防治、生物防治、化學(xué)防治等措施的合理應(yīng)用。農(nóng)業(yè)防治中多采用輪作的方式預(yù)防根腐病的發(fā)生，但是輪作要求年限比較長(zhǎng)，一般是8～10 a，耗費(fèi)時(shí)間、人力、物力，且經(jīng)濟(jì)效益不理想[7]。生物防治主要采用施用生物菌肥[8]、抑菌內(nèi)生真菌[9]等措施。也有研究發(fā)現(xiàn)，生物質(zhì)材料對(duì)三七土傳性病害具有良好的控制作用[8]?；瘜W(xué)防治多采用化學(xué)藥劑灌根或進(jìn)行土壤熏蒸等方式處理[10]，嚴(yán)重影響藥材品質(zhì)，且破壞土壤結(jié)構(gòu)、抑制土壤中微生物的繁殖。

目前利用植物提取物或精油防治植物病蟲(chóng)害的研究逐年增多。而植物來(lái)源的天然產(chǎn)物既有預(yù)防作用又有治療作用，同時(shí)又具有較低的毒性和副作用[11]。近年來(lái)，研究者們非常關(guān)注從植物中分離的提取物和生物活性化合物，并分析其藥理活性[12]。GRZESIK 等[13]研究表明，植物的治療作用歸因于其所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要分為生物堿、萜類(lèi)和酚類(lèi)。TLILI 等[14]研究了幾種突尼斯傳統(tǒng)芳香植物，結(jié)果表明，供試植物中顯著存在次生代謝產(chǎn)物，且涉及多種生物活性。

本試驗(yàn)主要通過(guò)多種植物源粗提取物對(duì)三七根腐病病原菌進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，篩選出其中具有良好抑菌效果的一種或幾種，作為后續(xù)研究防治該病害的原材料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌種為三七根腐病病原菌，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

供試植物材料有苦楝子（Melia azedarach Linn）、百里香（Thymus mongolicus Ronn）、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）、地膚子（Kochia scoparia Schrad）、決明子（Cassiae Semen）、芫花（Daphne genkwa）、瑞香狼毒（Stellera chamaejasma L.）、八角茴香（Illicium verum Hook.F.）、博落回（Macleaya cordata（Willd.））等9 種植物藥材，購(gòu)自安國(guó)市聚福中藥材有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物提取物的提取 稱(chēng)取植物粉末，按照提取物干粉與有機(jī)溶劑（工業(yè)酒精）1∶5（m/V）的量裝入廣口瓶中，充分浸泡24 h，30 ℃超聲波輔助提取30 min 后，用循環(huán)水式真空泵抽濾，將剩余濾渣收集再次進(jìn)行超聲波提取，再進(jìn)行抽濾，上述步驟共重復(fù)5 次，收集濾液；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)濾液進(jìn)行減壓真空濃縮，收集濃縮液得到植物提取物原液，測(cè)定原液質(zhì)量濃度后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 培養(yǎng)基的制備 試驗(yàn)所用培養(yǎng)基均為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），配制方法參考文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。

1.2.3 9 種植物提取物對(duì)三七根腐病病原菌菌絲生長(zhǎng)抑菌活性的測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[16]進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。采用十字交叉法測(cè)量72、96 h 時(shí)經(jīng)過(guò)9 種提取物處理的病原菌的菌落直徑（mm），根據(jù)公式計(jì)算每種植物提取物在2 mg/mL 時(shí)的抑制率。

1.2.4 苦楝子提取物對(duì)三七根腐病病原菌的毒力測(cè)定 針對(duì)三七根腐病菌，選取抑制效果最好的植物提取物，利用二倍稀釋法將苦楝子提取物配制成1、0.5、0.25、0.125、0.063 mg/mL 等5 個(gè)質(zhì)量濃度，制作加藥培養(yǎng)基，其中，PDA 培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)量24、48、72、96 h 時(shí)苦楝子提取物處理的病原菌的菌落直徑，并計(jì)算抑制率，統(tǒng)計(jì)分析得到不同植物提取物對(duì)病原菌的毒力方程和抑制中濃度EC50。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel、SAS、SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 9 種植物粗提取物對(duì)三七根腐病菌的抑制效果

從表1 可以看出，通過(guò)對(duì)比分析，質(zhì)量濃度為2 mg/mL 時(shí)，苦楝子提取物對(duì)三七根腐病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好，72、96 h 均無(wú)菌絲生長(zhǎng)，抑制率均為100%。

表1 9 種植物提取物對(duì)三七根腐病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

2.2 不同質(zhì)量濃度苦楝子對(duì)三七根腐病病原菌的抑制效果

表2 不同質(zhì)量濃度苦楝子提取物對(duì)三七根腐病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

從表2 可以看出，苦楝子提取物隨著質(zhì)量濃度的增大，對(duì)三七根腐病病原菌的抑制效果在逐漸增強(qiáng)，在1 mg/mL 時(shí)對(duì)三七根腐病病原菌的抑制率在60%以上，抑制作用顯著；在低質(zhì)量濃度下抑制作用不顯著，抑菌效果較差。

2.3 苦楝子提取物對(duì)三七根腐病病原菌的毒力分析

選取96 h 的數(shù)據(jù)運(yùn)用SAS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別得出毒力回歸方程和抑制中濃度（EC50），結(jié)果顯示，苦楝子提取物對(duì)三七根腐病病原菌的毒力回歸方程為：Y＝5.449 2＋2.054 2X，根據(jù)毒力回歸方程進(jìn)一步計(jì)算得出苦楝子提取物對(duì)三七根腐病病原菌的EC50為0.60 mg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.982 1，接近于1。

2.4 苦楝子提取物對(duì)三七根腐病病原菌菌絲形態(tài)的影響

三七根腐病病原菌菌絲形態(tài)為：菌絲頂端平滑，呈蠕蟲(chóng)狀，菌絲細(xì)長(zhǎng)，菌絲內(nèi)部無(wú)橫隔（圖1-A）。

在顯微鏡下觀察用藥處理96 h 后質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的菌落菌絲形態(tài)，結(jié)果表明，苦楝子提取物處理的菌絲與對(duì)照相比，菌絲頂端膨大，表面不光滑，中部出現(xiàn)異常突起，出現(xiàn)分枝、短小且縊縮，菌絲內(nèi)部壁上出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)，附著在菌絲細(xì)胞膜上（圖1-B、C）。

3 結(jié)論與討論

三七根腐病病原菌主要是病原真菌、線蟲(chóng)和假單胞菌[17]。其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，發(fā)病植株癥狀最為明顯，主要表現(xiàn)為6 種：黃腐型、干裂型、髓爛型、濕腐型、莖基干枯型、急性青枯型[18]。作為一種土傳性病害，其常年的發(fā)病率在5%～20%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)70%甚至出現(xiàn)絕產(chǎn)的情況[19]，春秋季為發(fā)病高峰期[20]。

目前對(duì)于三七的研究仍主要集中在藥理方面，對(duì)于其病害防治暫無(wú)突破性進(jìn)展。本試驗(yàn)通過(guò)生長(zhǎng)速率法，從9 種植物提取物中篩選出具有抑菌效果的苦楝子，發(fā)現(xiàn)作用96 h 后，在質(zhì)量濃度為2 mg/mL下，對(duì)三七根腐病病原菌的抑制率為100%，EC50為0.60 mg/mL，并通過(guò)對(duì)菌絲形態(tài)的觀察，證實(shí)苦楝子提取物對(duì)該病原菌具有良好的抑菌活性?？嚅犹崛∥飳?duì)菌絲的影響可能是由于逆境刺激而產(chǎn)生厚垣孢子和短小分枝，阻礙病原菌的生殖生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，降低孢子產(chǎn)量，以達(dá)到抑菌的目的。

綠色天然的植物源殺菌劑是既對(duì)病原菌有抑菌效果，同時(shí)又能夠提高寄主的免疫力。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)植物源殺菌劑進(jìn)行了大量研究，主要還是集中在離體環(huán)境下抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)[21]。也有研究者發(fā)現(xiàn)，植物精油能夠破壞真菌生物膜系統(tǒng)，從而降低其穩(wěn)定性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂[22]。陳楚英等[23]采用牛津杯法驗(yàn)證了白薇醇提物能夠使意大利青霉菌菌絲膨大、畸形，高濃度下可使菌絲斷裂、內(nèi)含物消解，從而達(dá)到抑制菌絲生長(zhǎng)的效果。本研究結(jié)果表明，苦楝子提取物能使三七根腐病病原菌菌絲膨大，出現(xiàn)短小且縊縮分枝。有關(guān)苦楝子提取物能否誘導(dǎo)三七植株防御性酶活性的提高以及抑制三七根腐病病原菌菌絲生長(zhǎng)的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。