外源NO 對紫莖澤蘭提取物脅迫下黃瓜種子萌發(fā)及幼苗根系抗氧化系統(tǒng)的影響

魯一薇，李 穎，劉 朦，曹永恒，孫娜娜，馬金虎，楊小環(huán)

（1.山西農業(yè)大學農學院，山西太谷030801；2.山西農業(yè)大學工學院，山西太谷030801）

紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum）是一種雜草，侵犯其他植物的能力十分強大。研究發(fā)現，紫莖澤蘭的地上部分石油醚、乙醇和水提取物對多種糧食作物及蔬菜種子的萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育均有抑制作用[1]。已有人根據這一特性擬將紫莖澤蘭開發(fā)成植物源除草劑、殺蟲劑、殺菌劑[2]，用來預防植物的病蟲害。

一氧化氮（NO）是一種分子信號，在植物生長發(fā)育及其抵抗逆境方面起著重要作用[3]。低濃度NO對植物有一定的促進作用，但高濃度會抑制植物生長，甚至造成毒害[4]。李慧[5]研究表明，施用NO 后會使小麥葉片氣孔關閉，減少小麥的水分蒸騰，從而提高抗旱能力。趙倩[6]研究表明，NO 可增強小麥種子和幼苗對提取物化感脅迫的耐性，減低幼苗根邊緣細胞的死亡率。趙穎等[7]研究發(fā)現，低濃度外源NO 可提升滲透脅迫下紫花苜蓿種子的萌發(fā)。吳曉蕾等[8]研究發(fā)現，添加適宜濃度的硝普鈉溶液顯著促進了低氧脅迫下黃瓜幼苗的株高、干鮮質量、光合等指標，緩解效果明顯。肖小君等[9]研究結果表明，在Pb 脅迫下，100 μmol/L 硝普鈉溶液處理的效果最好，顯著提高了保護酶的活性，增強了細胞的滲透調節(jié)能力，減緩了對水果黃瓜種子的傷害。外源NO 能提高干旱脅迫下高羊茅種子的發(fā)芽率[10]。薛盈文等[11]、路瑩等[12]研究發(fā)現，NO 能促進鹽脅迫下玉米幼苗及沙蔥種子的根系（胚根）生長。目前關于外源NO 緩解紫莖澤蘭提取物脅迫下黃瓜生長的研究鮮見報道。

本試驗研究外源NO 對紫莖澤蘭提取物傷害下黃瓜種子的萌發(fā)、幼苗根系結構的破損程度和根部抗氧化系統(tǒng)的影響，探討NO 緩解紫莖澤蘭提取物脅迫黃瓜種子萌發(fā)和幼苗生長的效應，旨在為NO 在植物栽培應用上提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試黃瓜品種為津優(yōu)35 號，購于山東省聊城市瑞豐種業(yè)有限公司。

將采自云南普洱市的紫莖澤蘭植株葉片，陰干粉碎后用95%乙醇，按料液比1∶4 浸提2 d，重復提取3 次，合并提取液，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，將濃縮液置低溫真空干燥箱中干燥至恒質量。提取物用丙酮溶解成液體保存?zhèn)溆茫? g 提取物用5 mL 丙酮溶解，提取物溶液濃度為0.2 g/mL）。

NO 供體為硝普鈉[Na2Fe（ON）5]（用SNP 表示），購自Sigma 公司。

1.2 試驗方法

試驗于2015 年3—7 月在山西農業(yè)大學農學院進行。設置去離子水（CK）、0.05 mmol/L SNP 的水溶液（NO）、1 g/L 紫莖澤蘭提取物水溶液（ZL）和1 g/L 紫莖澤蘭提取物＋0.05 mmol/L SNP 的混合溶液（ZN）4 種處理。采用紙卷發(fā)芽法[13]進行種子萌發(fā)試驗，隔1 d 換一次處理液，直至對照不再萌發(fā)結束試驗。種子萌發(fā)生長過程中，分別在4、6、8、10、12 d 取幼苗根系液氮保存用于后續(xù)各項生理指標的測定。同時，取萌發(fā)生長4 d 不同處理的幼苗根尖，制備電鏡掃描的樣品。不同處理設3 次重復。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 種子發(fā)芽指標的測定 按種子檢驗規(guī)程[14]測定發(fā)芽率等各個指標和幼苗芽長、主根長和干鮮質量。

其中，Ga 為4 d 發(fā)芽種子數；Gn 為供試種子數；Ta 為8 d 發(fā)芽種子數；Gt 為發(fā)芽種子數；Dt 為發(fā)芽天數；W 為20 株生長12 d 的幼苗鮮質量。

1.3.2 電鏡掃描樣品的制作 取不同處理的幼苗，切取幼苗胚根尖（約1 cm）迅速放到3%戊二醛固定液中，0～4 ℃下固定2 d。用磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH＝7.2）洗滌3 次，每次15 min，依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇系列脫水（每一梯度脫水15 min），最后100%的乙醇脫水2 次，每次20 min，后用叔丁醇置換，JEOL JFD-320 冷凍干燥，將干燥好的材料用導電膠帶黏在樣品臺上，用JEOL JFC-1600 離子濺射鍍膜儀噴鍍鉑金，噴鍍好的材料放入JEOL JEM-6490 LV 掃描電子顯微鏡下觀察拍照[15]。

1.3.3 生理指標的測定 過氧化氫酶（CAT）活性測定采用H2O2紫外吸收法；過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑法；可溶性蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍染色法；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸TBA 顯色法測定[16]；抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定參照沈文飚等[17]的方法；超氧陰離子（）含量測定參照李忠光等[18]的方法；還原型抗壞血酸（AsA）測定參照鄒琦[19]的方法。

1.4 數據統(tǒng)計及分析

試驗數據均用SPSS 軟件處理，采用Duncan 新復極差法檢驗數據顯著性差異（α＝0.05）。測定結果為重復3 次的平均值。

2 結果與分析

2.1 NO 對紫莖澤蘭提取物脅迫下黃瓜種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

由圖1、2 可知，紫莖澤蘭提取物（ZL）處理中，幼苗側根減少，與對照（CK）相比，種子發(fā)芽指數、活力指數、主根長及幼苗鮮質量分別減少17.65%、48.66%、62.08%和37.48%，說明ZL 抑制了黃瓜種子萌發(fā)和幼苗生長；而ZN 處理下，種子的各個測定指標量與ZL 處理相比均提高，種子的活力指數、幼苗鮮質量、主根長增幅分別為35.69%、18.25%和49.14%，說明噴施NO 能減輕提取物對黃瓜種子和幼苗的脅迫傷害。

2.2 NO 對紫莖澤蘭提取物脅迫下黃瓜幼苗根尖組織結構的影響

由圖3-A 和圖3-D 可知，對照和NO 處理的黃瓜幼苗根尖在100 倍電鏡下觀察，根尖細胞平滑整齊，根尖沒有被傷害。ZL 處理對黃瓜幼苗根尖結構破壞非常大，表層細胞凋落，排列無規(guī)律，細胞形狀改變（圖3-G）；添加NO 處理（ZN）后，與對照和NO 處理比較，黃瓜根尖細胞的組織結構基本相當（圖3-J）。表明NO 能有效緩解紫莖澤蘭提取物對黃瓜根尖組織結構的脅迫。

2.3 NO 對紫莖澤蘭提取物脅迫下黃瓜幼苗根系抗氧化系統(tǒng)的影響

由圖4 可知，在幼苗生長過程中，ZL 處理下幼苗根系SOD、POD、CAT和APX 活性高于CK。與CK相比，ZL 處理的幼苗SOD 活性在4、6、8、10、12 d時分別比對照提高20.38%、139.85%、36.22%、36.98%和12.77%，達到顯著性差異（P＜0.05）；ZL 處理的幼苗POD 活性在4、6、8、10、12 d 時分別比CK 提高89.23%、135.25%、59.61%、69.87%和160.75%。ZL 處理的幼苗CAT 活性在4、6、8、10、12 d 時分別比CK 提高139.50%、69.85%、43.57%、56.36%和36.62%，達到顯著性差異（P＜0.05）；ZL 處理的幼苗APX 活 性 在4、6、8、10、12 d 時 分 別 比CK 提 高22.96%、36.55%、20.99%、12.31%和9.00%，達到顯著性差異（P＜0.05）。與ZL 處理相比，ZN 處理的SOD、POD、CAT 和APX 活性普遍高于ZL 處理。其中，ZN 處理下SOD 活性在8、12 d 時分別比ZL 處理高23.58%和52.74%，達到顯著差異（P＜0.05）；POD 活 性 在6、8、10、12 d 時 比ZL 處 理 分 別 高22.74%、19.63%、13.31%和7.13%，差異達顯著性水平（P＜0.05）；CAT 活性在8、10 d 時分別比ZL 處理提高22.62%和20.46%，差異達顯著水平（P＜0.05）；APX 活性在4、6、8、10、12 d 時比ZL 處理分別高9.73%、6.62%、4.20%、9.63%和4.63%，10 d 時達到顯著差異（P＜0.05）。

從圖5 可以看出，ZL、ZN 處理下MDA、超氧陰離子（）、抗壞血酸AsA 和可溶性蛋白含量均高于CK。與CK 相比，ZL 處理的MDA 含量在4、6、8、10、12 d 時分別增加49.21%、44.23%、11.24%、20.93%和25.50%；ZL 處理的含量在4、6 d 時較CK 分別增加29.28%和26.02%；ZL 處理的AsA 含量在4、6、8、10、12 d 時較CK 分別增加139.91%、44.81%、87.92%、41.48%和47.53%；ZL 處理的可溶性蛋白含量在4、6、8、10、12 d 時較CK 分別增加71.22%、59.61%、29.71%、46.06%和54.69%，均達到顯著差異（P＜0.05）。且不同時間段ZN 處理的MDA 和超氧陰離子含量低于ZL 處理，而ZN 處理的AsA 和可溶性蛋白含量高于ZL 處理。與ZL 處理相比，ZN 處理的MDA 含量在4、6、8、10、12 d 時分別降低4.18%、6.41%、3.60%、7.79%和11.48%，12 d 時達到顯著性差異（P＜0.05）；ZN 處理的含量在4、6、8、10、12 d 時分別降低3.33%、1.32%、2.31%、6.50%和0.78%，但差異不顯著；ZN 處理的AsA 含量在4、6、8、10、12 d 時分別增加4.15%、10.43%、14.23%、5.63%和7.08%，8 d 時差異顯著（P＜0.05）；ZN 處理的可溶性蛋白含量在4、6、8、10、12 d 時分別上升了9.23%、5.79%、21.37%、8.26%和3.80%。

由圖4、5 分析可知，紫莖澤蘭提取物對黃瓜種子萌發(fā)有一定的傷害，MDA 和超氧陰離子（）含量升高，幼苗內產生的活性氧增多從而使植物細胞的膜脂過氧化程度加劇，同時也誘導SOD、POD、CAT、APX 抗氧化酶活性、可溶性蛋白和抗氧化劑AsA 含量升高，外源NO 不同程度提高了紫莖澤蘭提取物脅迫下黃瓜幼苗根系抗氧化酶活性和抗氧化劑AsA 含量，從而降低膜脂過氧化程度，增強了幼苗抗紫莖澤蘭提取物脅迫的能力。

3 討論

3.1 外源NO 緩解紫莖澤蘭提取物對黃瓜種子萌發(fā)和幼苗生長傷害的效應

化感物質是一種脅迫信號，通常作用于受體植物的細胞表面，細胞內部結構被破壞，影響受體植物的生長發(fā)育[19]，徐成東等[20]、曹子林等[21]的研究證實了這一點。試驗結果顯示，1 g/L 紫莖澤蘭提取物水溶液脅迫下，黃瓜種子萌發(fā)生長的多項指標均顯著低于對照。由此推測，紫莖澤蘭提取物產生的化感物質可能抑制黃瓜種子萌發(fā)和幼苗的生長，還有待進一步的深入研究。添加外源NO 處理（ZN），黃瓜種子萌發(fā)生長的多項指標均明顯好于ZL 處理。說明，外源NO 參與紫莖澤蘭提取物對黃瓜種子萌發(fā)和幼苗生長脅迫的調節(jié)，增強了黃瓜對紫莖澤蘭提取物脅迫的適應性，可有效地緩解提取物對黃瓜種子萌發(fā)和幼苗生長的破壞。

3.2 外源NO 緩解紫莖澤蘭提取物對黃瓜幼苗根尖組織結構損傷的效應

化感脅迫誘導植物細胞損傷，細胞外部形狀發(fā)生變化。曾有研究報道，蠶豆被三葉鬼針草（Bidens pilosa L.）水浸提液處理，其根尖橫切面和縱切面細胞明顯變小，細胞緊湊整齊排列，徑向細胞層數增加[22]。紫莖澤蘭內部主要的化感物質會導致根尖組織結構受到傷害，細胞變小，細胞質變薄[23]。本試驗結果表明，紫莖澤蘭提取物脅迫使幼苗根尖表層細胞脫離下來，細胞排列順序雜亂，因此，紫莖澤蘭提取物對黃瓜幼苗根尖組織結構造成嚴重的損傷，而添加NO 處理（ZN），根尖表面無凹凸，細胞排列整齊、緊湊、飽滿，無干癟萎焉現象，與對照和NO 處理（NO）相比差異不顯著。說明，外源NO 可顯著緩解紫莖澤蘭提取物對黃瓜幼苗根尖組織結構的損傷，保證根尖細胞良好的生長發(fā)育。

3.3 外源NO 緩解紫莖澤蘭提取物對黃瓜幼苗根系抗氧化系統(tǒng)的效應

化感脅迫往往伴隨氧化脅迫的發(fā)生，當受體細胞受到化感脅迫時，細胞內抗氧化酶活性迅速升高，及時清除ROS，使ROS 含量被控制在較低水平[24]。隨著化感脅迫時間的延長，植物應激反應下降，酶活性降低，不足以消除ROS，加劇了膜脂過氧化程度。本試驗結果表明，不同時間段紫莖澤蘭提取物脅迫處理（ZL），黃瓜幼苗根系SOD、POD、CAT 和APX 活性、MDA 和超氧陰離子（）含量均高于CK，且隨著脅迫時間的延長，抗氧化酶活性呈先升高后下降，抗壞血酸AsA 和可溶性蛋白含量迅速下降，MDA 含量在脅迫后期（10～12 d）迅速升高。說明，紫莖澤蘭提取物對黃瓜幼苗根系產生了氧化脅迫傷害。

吳雪霞[25]研究表明，外源NO 能夠增強NaCl 脅迫下番茄和黃瓜幼苗葉片SOD、POD、CAT 和APX活性。本試驗結果表明，添加外源NO 處理（ZN），紫莖澤蘭提取物脅迫下黃瓜幼苗根系SOD、POD、CAT 和APX 活性明顯提高，與吳雪霞[25]的研究結果相似。說明，外源NO 參與了CAT 和APX 等抗氧化酶的代謝調節(jié)，外源NO 通過誘導抗氧化酶活性升高，從而提高了黃瓜幼苗根系抗氧化能力。

抗壞血酸AsA 是植物體內重要的抗氧化物質，在APX 存在下，AsA 可清除活性氧[26]。本試驗中，隨紫莖澤蘭提取物脅迫時間延長，AsA 含量下降，APX 活性先升高后下降，超氧陰離子（O2-）含量升高，表明細胞內ROS 含量積累，激發(fā)黃瓜自身應激以抵抗逆境，導致清除H2O2的APX 活性迅速增加，6 d 時達到峰值。在幼苗生長后期（8～12 d），黃瓜幼苗為抵抗脅迫傷害消耗大量的AsA，使其含量迅速下降，由于AsA 含量的減少使APX 活性也急速下降，從而導致H2O2不能被分解，膜脂過氧化加劇，MDA 含量增加，幼苗受到脅迫傷害[27]。在本試驗中，ZN 處理的不同時間段，黃瓜幼苗根系中AsA 含量、APX 活性普遍比ZL 處理高，有可能是因為NO參與黃瓜自身應激反應的調控，使AsA 含量、APX活性保持在較高的水平，減輕提取物對黃瓜幼苗的傷害，還有待進一步研究。

4 結論

本研究結果表明，紫莖澤蘭提取物抑制種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育，對幼苗根系產生氧化脅迫，破壞根的組織結構。外源NO 能顯著緩解紫莖澤蘭提取物對幼苗根系的氧化脅迫傷害，增強幼苗的抗逆性，促進幼苗生長。