雨生紅球藻植物類型隱花色素基因克隆與序列分析

杭 偉，張宏江，馬浩天，王曉丹，許文鑫，趙春超，李潤植，崔紅利

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷030801）

光照是植物生長的能量來源，也是介導(dǎo)植物光形態(tài)建成和生物節(jié)律的環(huán)境影響因子。CASPARY研究發(fā)現(xiàn)，光照條件下東爪草（Tillea aquatica）種子的發(fā)芽率達(dá)到最高[1]。BORTHWICK 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，640～670 nm 紅光（R）能有效促進(jìn)萵苣種子萌發(fā)，而720～750 nm 遠(yuǎn)紅光（FR）則抑制萵苣種子萌發(fā)。低劑量的紫外光UV-B（290～300 nm）影響植物下胚軸伸長、子葉伸展、葉片光合作用和生物節(jié)律[3-4]。

光合作用的生物在進(jìn)化的過程中獲得了復(fù)雜而又精細(xì)的光感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路，其中，光受體在這個(gè)信號通路中發(fā)揮著重要的作用[3-4]。植物細(xì)胞內(nèi)分布著大量感知光信號的光受體蛋白。根據(jù)不同波長的光譜，將光受體分為3 類光受體：感受紅光/遠(yuǎn)紅光（600～750 nm）的3～5 種光敏色素受體（PHYs），感受藍(lán)光和UV-A（390～500 nm）的8 個(gè)藍(lán) 光 受 體（CRY1、CRY2、CRY-DASH、ZTL、FKF1、LKP2、PHOT1、PHOT2），感受紫外UV-B（280～315 nm）的1 個(gè)紫外光受體UVR8[5-7]。有關(guān)光受體功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究是近年來光化學(xué)和光遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[8-9]。

隱花色素（CRYs）是屬于隱花色素/光裂解酶（cryptochrome/photolyase，CPF）基因家族，廣泛分布于動物、植物、藻類[10]，能被藍(lán)光激活的受體蛋白，具有調(diào)控植物光形態(tài)發(fā)生和生物節(jié)律的功能[11]。隱花色素最早在雙子葉植物擬南芥中被發(fā)現(xiàn)[12]。在擬南芥當(dāng)中，隱花色素主要分為3 類：CRY1、CRY2、CRY-DASH。CRY1 和CRY2 主要是植物感受外界光信號的光受體，參與調(diào)控植物光周期開花和植物光形態(tài)建成過程；CRY-DASH 具有修復(fù)由光造成的ssDNA 和dsDNA 損傷的能力[13]。高等植物關(guān)于隱花色素的研究較多，在番茄（Lycopersicon esculentum）、大豆（Pisum sativum）、玉米（Zea mays）等高等植物上研究也較多[14-16]。在真核藻類當(dāng)中，關(guān)于藻類中隱花色素的研究較少。綠藻萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhartii）和團(tuán)藻（Volvox carteri）中，分別存在4 個(gè)CRYs，一個(gè)植物類型（CPH1）、一個(gè)動物類型（aCRY）和2 個(gè)DASH 類型[17-18]。在藍(lán)關(guān)和紅光條件下，發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻的動物類型隱花色素（aCRY）與調(diào)控細(xì)胞周期循環(huán)、節(jié)律調(diào)節(jié)、葉綠素及類胡蘿卜素合成等關(guān)鍵基因在轉(zhuǎn)錄水平上相關(guān)聯(lián)。隨著轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)的公開，在海洋真核綠藻（Ostreococcus tauri）中發(fā)現(xiàn)動物類型CRY（aCRY）[19-20]。

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一株高產(chǎn)蝦青素的單細(xì)胞真核綠藻，在脅迫條件下蝦青素含量可達(dá)到細(xì)胞干質(zhì)量的4%[21]。相關(guān)研究表明，在藍(lán)光條件下，雨生紅球藻合成蝦青素相關(guān)基因高表達(dá)，蝦青素大量積累[22]。但是，這些基因被激活的作用機(jī)制尚不清楚。研究表明，在高等植物中，CRYs 光受體介導(dǎo)信號通路可調(diào)控植物體內(nèi)類胡蘿卜素合成[23-24]。但目前，尚未見雨生紅球藻中CRYs的克隆及功能研究相關(guān)報(bào)道。

本試驗(yàn)以真核綠藻雨生紅球藻為研究對象，采用同源克隆的方法克隆雨生紅球藻植物類型CRY基因cDNA 序列，并對序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為Hae-P-CRY 基因的表達(dá)、功能、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及互作蛋白的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料 試驗(yàn)所用雨生紅球藻藻株Flotow 1844 購自藻類和原生生物培養(yǎng)中心，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所藻種庫保存。培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度25 μmol/（m2·s），溫度（22±1）℃，采用BG 11 液體[25]培養(yǎng)基于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。光周期設(shè)置為12 h/12 h 的光/暗周期。本試驗(yàn)用LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌TOP 10。LB 培養(yǎng)基成分，包括10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母萃取物，10 g/L NaCl，用5 mol/L NaOH 調(diào)至7.0～7.2，定容，高壓滅菌15～20 min。LB 固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入1.5%的瓊脂。

1.1.2 試劑 提取RNA 的試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RACE 試劑盒、PCR 試劑盒、DNA 片段回收試劑盒及測序載體（PMD-18T）等均購買于Takara 生物公司，瓊脂糖購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 儀器 SW-CJ-2D 超凈工作臺（上海博訊醫(yī)療生物儀器有限公司）、GTOP 光照培養(yǎng)箱（浙江托普儀器有限公司）、DYCP-31BN 核酸電泳儀（昆山廣測儀器設(shè)備有限公司）、VeriFlexTM 96 PCR 儀（上海愛測電子科技有限公司）、GelDox XR Bio 凝膠成像儀（上海艾研生物科技有限公司）、小型低溫高速離心機(jī)（上海繼普電子科技有限公司）、Nano Drop 2000 分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA 的提取 采用Takara 公司的RNA提取試劑盒，具體過程參考產(chǎn)品說明書，提取后的RNA 于-80 ℃保存。

1.2.2 模板的制備 包括普通cDNA 模板的制備和RACE 模板制備兩大類。普通模板的制備參照Takara 公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with Gdna Eraser 的cDNA 制備試劑盒說明書進(jìn)行，包括基因組DNA 處理和反轉(zhuǎn)錄2 步。RACE 模板的制備參照Clontech 公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplication Kit 的RACE 試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 在比較基因組學(xué)分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)與雨生紅球藻物種相近的4 株綠藻物種，分別為萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhartii）、團(tuán)藻（Volvox carteri）、小球藻（Chlorella vulgaris）和膠球藻（Coccomyxa sp.C-169）隱花色素CRY 基因序列比對的結(jié)果，找出高度保守的氨基酸序列，用CODEHOP軟件設(shè)計(jì)兼并引物。根據(jù)同源克隆片段設(shè)計(jì)RACE引物，在獲得全長的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)表達(dá)框引物（表1），引物合成由上海生工生物工程公司完成。

表1 試驗(yàn)所用引物序列

1.2.4 同源片段的獲得 以1.2.2 中制備的普通cDNA 為模板，結(jié)合設(shè)計(jì)的同源克隆引物，采用Takara 公司的Takara LA TaqR擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃5 min，1 個(gè)循環(huán)；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃60 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min，4 ℃保溫。循環(huán)結(jié)束后，取3 μL PCR 產(chǎn)物，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)引物位置確定目的條帶的大小，將可能的目的條帶進(jìn)行回收，進(jìn)行后續(xù)的連接、轉(zhuǎn)化及測序。

1.2.5 cDNA 全長的獲得 在獲得同源片段的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)RACE 引物（表1），以1.2.2 中制備的RACE cDNA 為模板，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行兩段片段的PCR。產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、連接、轉(zhuǎn)化及挑選陽性克隆測序。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 Hae-P-CRY 基因cDNA全長序列通過軟件SeqMan software of DNAStar 7.1（DNASTAR Inc.，USA）拼接得到；序列翻譯和ORF的查找借助在線軟件（http：//www.bio-soft.net/sms/）進(jìn)行。利用Clustal W 軟件[26]進(jìn)行多序列比對分析。目的基因翻譯氨基酸的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)（pI）和理化性質(zhì)采用ExPASy Compute pI/Mw tool 軟件預(yù)測。結(jié)構(gòu)域分析通過在線SMART 和Pfam 軟件進(jìn)行[27]，利用PhyML 中的ML（Maximum likehood）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 雨生紅球藻總RNA 提取

獲得的總RNA 通過凝膠電泳進(jìn)行完整性的檢測，從圖1 可以看出，出現(xiàn)3 種條帶，從上到下分別為28S、18S、5.8S rRNA，說明RNA 質(zhì)量較好，較為完整。通過NanoDorp 2000 微量分光光度計(jì)檢測，A260/A280在1.8～2.0，滿足試驗(yàn)要求。

2.2 雨生紅球藻Hae-P-CRY 基因cDNA 序列的獲得

通過同源克隆和RACE 相結(jié)合的方法，獲得了雨生紅球藻中編碼隱花色素基因的cDNA 序列（Hae-P-CRY，NCBI 注冊號：MN073493）的全長。cDNA 全長3 608 bp，開發(fā)閱讀框2 988 bp，編碼區(qū)長度1 884 bp，編碼995 個(gè)氨基酸（圖2），5′- 非翻譯區(qū)（5′-UTR）長度為294 bp，3′- 非翻譯區(qū)（3′-UTR）長度為198 bp，并帶有poly（A）尾巴。通過Blast P程序分析，氨基酸序列與萊茵衣藻來源CRY 的相似性達(dá)到66.6%。

2.3 雨生紅球藻Hae-P-CRY 的理化性質(zhì)分析

利用ProtParam 軟件分析Hae-P-CRY 基本理化性質(zhì)。開放閱讀框翻譯的氨基酸預(yù)測分子質(zhì)量為107.7 ku，預(yù)測等電點(diǎn)為6.19。由20 種氨基酸組成，構(gòu)成了總數(shù)為627 個(gè)氨基酸的蛋白，含量較高的氨基酸是丙氨酸（Ala，12.3%）、甘氨酸（Gly，9%）和脯氨酸（Pro，8.2%），含量較低的氨基酸是絲氨酸（Ser，8.0%）。其中含有人體內(nèi)必需氨基酸，如賴氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸等。

2.4 雨生紅球藻Hae-P-CRY 的二級結(jié)構(gòu)分析

通過PORTER 軟件分析（圖3），獲得Hae-PCRY二級結(jié)構(gòu)主要包括：α- 螺旋、β- 折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲。其中，無規(guī)則卷曲所占比例最高，為48.94%；α- 螺旋、β- 折疊和延伸鏈分別占到35.08%、6.73%和9.25%?？梢耘卸?，Hae-P-CRY蛋白屬于混合型蛋白。

2.5 雨生紅球藻Hae-P-CRY 結(jié)構(gòu)域和序列比對分析

利用SMART 和CDD 軟件分析了Hae-P-CRY中的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，存在與Hae-P-CRY蛋白相關(guān)的結(jié)構(gòu)域有脫氧核糖二嘧啶光裂解酶（Deoxyribodipyrimidine photolyase）和脫氧核糖核酸光解酶（DNA photolyase）相關(guān)結(jié)構(gòu)域。運(yùn)用Clustal W軟件對Hae-P-CRY氨基酸序列與高等植物、藻類的隱花色素進(jìn)行了多序列比對分析。從圖4 可以看出，圖中的陰影面積較多，表明Hae-P-CRY 基因編碼的蛋白序列在不同植物和藻類中高度保守。在N端存在典型的保守光裂解酶（PHR）結(jié)構(gòu)域，含有輔基MTHF 和FAD，主要負(fù)責(zé)光感知功能。

2.6 雨生紅球藻Hae-P-CRY 的起源和系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過NCBI 庫Blast P 比對分析發(fā)現(xiàn)，高等植物和部分藻類都存在隱花色素（CRY）?？梢?，CRY 分布較廣。為了進(jìn)一步研究不同物種來源CRY 起源和系統(tǒng)進(jìn)化，本研究運(yùn)用MEGA 5.0 軟件將Hae-P-CRY與其他植物、細(xì)菌和藻類隱花色素的蛋白序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖5 所示。進(jìn)化樹結(jié)果表明，聚類分為4 種：6-4 光裂解酶、CRY-DASH、CPD、植物型CRY。目的序列Hae-P-CRY與綠藻綱萊茵衣藻親緣關(guān)系最近，并且與模式植物擬南芥植物型CRY 聚為一支，同屬于植物類型CRY。它們之間在進(jìn)化關(guān)系上可能存在共同的祖先。

3 討論

光不僅為真核微藻提供能量，而且作為重要的信號因子之一為它們提供信息，調(diào)節(jié)其生長發(fā)育過程[28]。真核微藻在漫長的進(jìn)化過程中形成了一套精細(xì)而又復(fù)雜的光信號感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。細(xì)胞光感知與體內(nèi)其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相耦聯(lián)，共同調(diào)控多種生理過程。例如，高等植物擬南芥和模式綠藻萊茵衣藻中CRYs 的研究表明，CRYs 參與感知藍(lán)光同時(shí)調(diào)控多種生理過程的信號通路，為雨生紅球藻中研究CRYs 的功能提供了線索[12，17]。

通過同源克隆和RACE 結(jié)合方法獲得了雨生紅球藻中編碼植物類型隱花色素（Hae-P-CRY）基因的cDNA 序列全長。Hae-P-CRY蛋白序列與擬南芥來源AtCRY 的相似性達(dá)到46.94%，與萊茵衣藻來源CreCRY 的相似性達(dá)到66.6%，暗示該基因可能是雨生紅球藻中可能的編碼植物類型隱花色素的基因。隱花色素蛋白由N 端氨基酸序列與光合裂解酶（Photolyase-homologous region）N 端氨基酸存在極高的相似性，稱之為PHR 結(jié)構(gòu)域，主要結(jié)合發(fā)色團(tuán)輔基MTHF 和FAD，負(fù)責(zé)同源二聚化和光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[29-30]。C 端CCE 結(jié)構(gòu)域較為特殊，因物種進(jìn)化之間的差異，序列存在多樣性，但是含有植物典型的DAS（DQXVP-Acidic-STAESS），功能主要表現(xiàn)在隱花色素調(diào)控植物生長發(fā)育[31]。大多數(shù)植物隱花色素CCE 結(jié)構(gòu)域要比動物隱花色素CCE 結(jié)構(gòu)域長，擬南芥CRY-DASH/CRY3 蛋白缺失了CCE 保守結(jié)構(gòu)域。擬南芥CRY1 和CRY2 的CCE 結(jié)構(gòu)域分別大約有180、110 個(gè)氨基酸殘基[32]。本研究所預(yù)測的Hae-P-CRY蛋白CCE 結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基有140 個(gè)，介于擬南芥CRY1 和CRY2 之間。結(jié)構(gòu)域分析表明，在Hae-P-CRY中同樣存在上述2 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步暗示這個(gè)基因編碼CRY 蛋白。通過進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，Hae-P-CRY蛋白序列與萊茵衣藻、擬南芥一型隱花色素聚為一支，預(yù)示著在進(jìn)化關(guān)系上，它們可能存在共同的祖先。

總而言之，上述研究結(jié)果為雨生紅球藻中Hae-P-CRY 的基因表達(dá)研究和確定其功能奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)保守結(jié)構(gòu)域的分析為藍(lán)光信號感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供了依據(jù)，并將有助于研究CRY 在藍(lán)光信號通路中相關(guān)調(diào)控因子的作用機(jī)制。例如，雨生紅球藻是天然蝦青素的理想來源，也是目前制備蝦青素的首選藻種。多種研究表明，高藍(lán)光可有效誘導(dǎo)其蝦青素的合成與積累，調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，但具體分子機(jī)制并不清楚。雨生紅球藻中CRY 基因的表達(dá)模式如何？是否具有功能？在藍(lán)光誘導(dǎo)下，體內(nèi)的CRY 如何感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)藍(lán)光信號，并如何與其他已知的蛋白（COP1 和CIBI 等）互作？互作之后通過何種途徑激活下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)從而啟動雨生紅球藻中蝦青素合成相關(guān)基因的表達(dá)，最終合成并積累蝦青素，這些問題都有待進(jìn)行研究。目前，由于有關(guān)CRY 的研究主要以高等植物擬南芥為主，CRY 介導(dǎo)的光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑中的許多疑問沒有解決，更多參與CRY 響應(yīng)藍(lán)光信號的轉(zhuǎn)錄因子有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。雨生紅球藻中CRY 基因的同源克隆和生物信息學(xué)分析對于今后更深入系統(tǒng)地研究CRY 蛋白響應(yīng)藍(lán)光的分子機(jī)制有一定的參考價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究獲得了雨生紅球藻中植物型隱花色素（CRY）的cDNA 全長序列并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，Hae-P-CRY 的開放閱讀框全長為2 988 bp，編碼995 個(gè)氨基酸，預(yù)測的等電點(diǎn)為6.19，理論分子質(zhì)量為107.7 ku。與擬南芥來源CRY的相似性達(dá)到46.94%，與萊茵衣藻來源CRY 的相似性達(dá)到66.6%。CRY 蛋白的典型結(jié)構(gòu)域存在于Hae-P-CRY 中，包括PHR 和CCE。高等植物和真核綠藻來源CRYs 屬于共同祖先。首次從雨生紅球藻中獲得編碼CRY 的基因序列，存在與高等植物CRY相似的結(jié)構(gòu)域，暗示其作用機(jī)制與高等植物類似，為下一步雨生紅球藻中CRY 的表達(dá)和功能研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為解析藍(lán)光調(diào)控雨生紅球藻蝦青素合成的分子機(jī)制提供線索。