燕麥籽粒皮裸性相關(guān)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆

張鳴凡，陳志偉，賈舉慶，張曉軍，李 欣，張春來(lái)，張美俊，楊武德

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031）

燕麥屬禾本科燕麥屬一年生草本植物，是世界各地廣泛栽培種植的一種糧、經(jīng)、飼、藥、草多用途作物[1]，具有耐寒抗旱、耐瘠薄、耐適度鹽堿、不與水稻小麥等其他禾谷類作物爭(zhēng)奪耕地以及農(nóng)業(yè)風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)低等優(yōu)良性狀[2]。燕麥品種可根據(jù)外稃形態(tài)學(xué)差異分為皮燕麥與裸燕麥2 種類型[3]。皮燕麥和裸燕麥的區(qū)別主要在于成熟后籽粒外包裹的谷殼是否容易與籽粒分離，其中，皮燕麥的外稃為革質(zhì)，質(zhì)地堅(jiān)硬，緊貼穎果；而裸燕麥的外稃為膜質(zhì)，質(zhì)地柔軟，容易與穎果分離。與皮燕麥相比，裸燕麥籽粒成熟時(shí)的小穗外穎薄且脆，與護(hù)穎類似，手搓易與穎果分開[4]。

籽粒皮裸性即為籽粒帶殼與籽粒不帶殼（裸粒）的一對(duì)相對(duì)性狀，研究該性狀對(duì)作物育種、起源馴化具有重要作用。盡管大麥等禾本科植物都有籽粒帶殼與裸粒2 種類型，但控制籽粒皮裸性的機(jī)制不完全一致[4]。在大麥中，根據(jù)圖位克隆確定ERF轉(zhuǎn)錄因子家族基因（Nud）控制大麥籽粒皮裸性。在皮、裸大麥中擴(kuò)增該目的基因發(fā)現(xiàn)，裸大麥的擴(kuò)增片段比皮大麥的擴(kuò)增片段缺失17 kb，并確認(rèn)缺失的17 kb 包含了整個(gè)ERF 基因；Nud 基因與擬南芥調(diào)控脂質(zhì)生物合成途徑的WIN1/SHN1 轉(zhuǎn)錄因子基因同源[5]。

燕麥尤其是六倍體裸燕麥（Avena nuda）是我國(guó)特有的物種，是世界上重要的糧食作物之一[6]。皮燕麥較裸燕麥有一定的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，尤其在抵抗外界不良環(huán)境及抗病性等方面[7]。由于二倍體燕麥較六倍體燕麥的基因組簡(jiǎn)單，因此，本研究克隆了二倍體燕麥中的大麥Nud 同源基因的AsNud，以及分析了一個(gè)二倍體皮燕麥（CIav2921）和一個(gè)二倍體裸燕麥（CIav9008）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，旨在為尋找控制燕麥籽粒皮裸性的基因提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

二倍體皮燕麥（CIav2921）、二倍體裸燕麥（CIav9008）的試驗(yàn)材料來(lái)自美國(guó)種質(zhì)資源庫(kù)，這2 個(gè)材料于2019 年5 月底種植在24 cm×19 cm 的花盆里。

1.2 皮、裸燕麥外稃形態(tài)觀察

在開花期取下附著于花序梗上的穗狀花序進(jìn)行表型分析。從成熟的小穗中取下外穎，并用鑷子分解第一小花，將外穎、外稃和內(nèi)稃從左至右擺好，置于體視顯微鏡下，選取合適的視野進(jìn)行拍照觀察，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并應(yīng)用cellSens Dimension 拍照軟件量化開花期外稃的面積。

1.3 PCR 引物設(shè)計(jì)、擴(kuò)增和測(cè)序

參照天根植物DNA 提取試劑盒說(shuō)明書從試驗(yàn)材料的幼葉中提取基因組DNA。參照大麥Nud 基因序列，在NCBI 燕麥EST 數(shù)據(jù)庫(kù)、燕麥基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中以及本試驗(yàn)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)燕麥基因組中已有的同源性最高的基因序列。利用Primer 3 在線軟件設(shè)計(jì)合適的PCR 引物。參照表1所示的試驗(yàn)條件，在CIav2921 和CIav9008 基因組DNA 中進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)TAE 緩沖液瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色觀察后，利用康為世紀(jì)Gel Extraction kit 試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后采用TaKaRa pMDTM18-T Vector 試劑盒將純化后的目的基因片段與T 載體連接。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有Amp 抗性的LB 固體平板上，對(duì)長(zhǎng)出的單克隆進(jìn)行陽(yáng)性克隆驗(yàn)證，挑選正確的單克隆菌液送至華大公司進(jìn)行測(cè)序。利用BioEdit 和DNAMAN 軟件對(duì)得到的測(cè)序序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析。

表1 PCR 引物序列和PCR 反應(yīng)條件

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

將目的基因所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與大麥[5]、擬南芥[8]、水稻和玉米[9]中該基因編碼的同源程度較高的蛋白質(zhì)氨基酸序列，在MEGA5.05[10]軟件中的ClustalW 模塊下進(jìn)行多重序列比對(duì)，并利用Neighbor-Joining 算法（執(zhí)行參數(shù)：Bootstrap method 1 000；Poissonmodel；Pairwise deletion）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 RNA 提取、cDNA 文庫(kù)構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

采用RNA 提取試劑盒提取CIav2921 和CIav9008 種子蠟熟期時(shí)花序的總RNA，檢測(cè)合格后交由諾禾致源公司進(jìn)行測(cè)序分析。cDNA 文庫(kù)采用cDNA 合成試劑盒（Illumina 美國(guó)）構(gòu)建，檢測(cè)合格的文庫(kù)利用HiSequTM2000（Illumina 美國(guó)）進(jìn)行測(cè)序。RPKM值（每百萬(wàn)reads 中來(lái)自某一基因每千堿基長(zhǎng)度的reads 數(shù)目）＞1 且P 值＜0.05 的基因被認(rèn)為是可表達(dá)的基因。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 和Microsoft office 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及方差分析，采用Origin 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 二倍體皮、裸燕麥外稃的形態(tài)學(xué)差異分析

開花期時(shí)的CIav2921 與CIav9008 的小穗相比，穎片（Glume）的形態(tài)學(xué)沒(méi)有差異，而外稃（Lemma）卻有明顯差異，其中，裸燕麥的外稃與穎片類似，能看到清晰的葉脈，表面無(wú)光澤；皮燕麥的外稃只在近上部1/3 處能看到葉脈，表面通體泛有光澤（圖1-A、C）。成熟期皮、裸燕麥的外穎和內(nèi)稃形態(tài)沒(méi)有差異，而外稃有差異，其中，裸燕麥的外稃舒展；皮燕麥的外稃彎曲，與籽粒緊密相連（圖1-B、D）。比較皮、裸燕麥外稃面積發(fā)現(xiàn)，裸燕麥的面積顯著大于皮燕麥的面積（圖1-E）。

2.2 AsNud 基因的分離與結(jié)構(gòu)分析

將大麥Nud 基因序列放入NCBI 燕麥EST 數(shù)據(jù)庫(kù)、燕麥基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)以及本試驗(yàn)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果在已有的燕麥基因組中找到同源性較高的4 條基因序列（GO593063.1、BMK_Unigene_060579、lcl|CTG24048、lcl|CTG76330）。其中GO593063.1 序列不完整，為一片段；將序列BMK_Unigene_060579 和GO593063.1 利用BioEdit 軟件比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，二者在共有的堿基處相似性極高，遂將BMK_Unigene_060579 之后的序列拼接到序列GO593063.1 之后，成為一條拼接序列。利用Primer 3在線軟件設(shè)計(jì)出的引物擴(kuò)增這5 條目的基因，經(jīng)切膠回收、T 載體連接、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性克隆驗(yàn)證、菌液測(cè)序后，將得到的序列利用BioEdit 軟件進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果認(rèn)為，序列BMK_Unigene_060579、序列GO593063.1 和拼接序列為同一條序列，記作AsNud1；序列l(wèi)cl|CTG24048 和序列l(wèi)cl|CTG76330 為同一條序列，記作AsNud2。

通過(guò)對(duì)AsNud 基因序列特征進(jìn)行分析，研究AsNud 基因序列的遺傳多樣性，結(jié)果顯示（表2），CIav2921AsNud1 基因組的DNA 長(zhǎng)度為744 bp、CIav9008AsNud1 基因組為744 bp、HvNud 為884 bp；CIav2921AsNud1 開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為48 bp、CIav9008AsNud1 開放閱讀框?yàn)?39 bp、HvNud 為684 bp；CIav2921AsNud1 預(yù)測(cè)的基因產(chǎn)物包含15 個(gè)氨基酸殘基，CIav9008AsNud1 為212 個(gè)氨基酸、HvNud 為227 個(gè)氨基酸；CIav2921AsNud1 估計(jì)分子 質(zhì) 量 為1.9 ku、CIav9008AsNud1 為22.8 ku、HvNud 為24.1 ku；CIav2921AsNud1 等電點(diǎn)為12.83、CIav9008AsNud1 為10.03、HvNud 為9.74。CIav2921 AsNud1 ORF 的GC 含量（54.17%）低于大麥HvNud ORF（65.64%）及全基因組DNA（61.20%），CIav9008 AsNud1 ORF 的GC 含量（61.19%）低于大麥HvNud ORF（65.64%） 及大麥基因組DNA（61.20%）。CIav2921AsNud1 與大麥HvNud 在基因組DNA 中核苷酸相似性為65.64%，而在ORF 與肽水平上，相似性分別為6.14%和6.17%；CIav9008AsNud1 與大麥HvNud 在基因組DNA、ORF 與肽水平上，其相似性分別為71.37%、73.68%和69.60%。

表2 HvNud 與燕麥同源基因AsNud 的同源性

CIav2921AsNud2 基因組DNA 長(zhǎng)度為886 bp、CIav9008AsNud2 基因組為890 bp、HvNud 為884 bp，CIav2921AsNud2 開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為612 bp、CIav9008AsNud2 開放閱讀框?yàn)?96 bp、HvNud 為684bp；CIav2921AsNud2 預(yù)測(cè)的基因產(chǎn)物包含203 個(gè)氨基酸殘基、CIav9008AsNud2 為231 個(gè)氨基酸、HvNud 為227 個(gè)氨基酸；CIav2921AsNud2 估計(jì)分子質(zhì)量為21.5 ku、CIav9008AsNud2 為24.5 ku、HvNud為 24.1 ku；CIav2921AsNud2 等 電 點(diǎn) 為 11.49、CIav9008AsNud2 為10.03、HvNud 為9.74。CIav2921 AsNud2 ORF 的GC 含量（68.46%）高于大麥HvNud ORF（65.64%）及全基因組DNA（61.20%）；CIav9008 AsNud1 ORF 的GC 含量（67.96%）高于大麥HvNud ORF （65.64%） 及 全 基 因 組DNA （61.20%）。CIav2921AsNud2 與大麥HvNud 在基因組DNA 中核苷酸相似性為83.15%，而在ORF 與肽水平上，相似性分別為78.51%和71.74%；CIav9008AsNud2 與大麥HvNud 在基因組DNA、ORF 與肽水平上，其相似性分別為84.27%、90.13%和85.71%。

對(duì) 預(yù) 測(cè) 的CIav2921、CIav9008AsNud 和 大 麥HvNud 編碼的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，AsNud1 與AsNud2 基因同HvNud 一樣，都具有一些保守的序列特征，包括AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域、保守的中間基序（mm）和保守的C 末端基序（cm）；除了這幾個(gè)保守結(jié)構(gòu)域外，AsNud1、AsNud2 與HvNud 又具有程度不一的差異。對(duì)比AsNud1 和AsNud2 基因在CIav2921 和CIav9008 中的差異發(fā)現(xiàn)，AsNud1 在二者中差異不大，而AsNud2 在二者中差異較大，特別是在C 末端。值得一提的是，CIav2921AsNud1 和CIav2921AsNud2 編碼的氨基酸有提前終止現(xiàn)象（AsNud1 基因在第17 位氨基酸處，AsNud2 基因在第204 位氨基酸處），而CIav9008 中則沒(méi)有此現(xiàn)象。（圖2-A、B）。

2.3 AsNud 同源基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

大麥HvNud 基因與擬南芥WIN1/SHN1 轉(zhuǎn)錄因子基因同源，其中，擬南芥有3 個(gè)（AtWIN1/SHN1、AtSHN2 和AtSHN3）同源程度很高且參與蠟質(zhì)和角質(zhì)合成調(diào)控過(guò)程的基因，均屬于AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族。將該轉(zhuǎn)錄因子下的6 個(gè)擬南芥基因（At1g15360、At5g11190、At5g25390、At5g25190、At5g67010 和At-2g20350）、同源程度很高的7 個(gè)水稻基因（Os02g1-0760、Os06g40150、Os06g08340、Os02g55380、Os04g-56150、Os02g32140 和Os04g32620）、3 個(gè)玉米基因（Zm2g085678、Zm2g111415 和Zm2g104260）、1 個(gè)西紅柿基因（LeERF1）以及根據(jù)大麥HvNud 基因同源克隆得到的2 個(gè)二倍體皮、裸燕麥基因（AsNud1和AsNud2）編碼的氨基酸序列在MEGA 5.05 軟件上經(jīng)ClustalW 多序列比對(duì)，采用鄰接法（Neighborjoining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。

從圖3 可以看出，AtWIN1/SHN1（At1g15360）、AtSHN2（At5g11190）和AtSHN3（At5g25390）在進(jìn)化樹上屬于同一個(gè)分支，其中，AtWIN1/SHN1 與水稻中的Os02ERF（Os02g10760）和Os06ERF（Os06g40150）、與皮、裸燕麥中的AsNud1 和AsNud2、與玉米中的Zm2g085678 和大麥HvNud 的同源程度比較高。另外，玉米的Zm2g085678 與Os02ERF 和AsNud1 同源程度很高，同屬于一個(gè)小進(jìn)化分支。Os06ERF 與HvNud 和AsNud2 同源程度很高，同屬于一個(gè)小進(jìn)化分支，在該分支中，AsNud2（CIav2921）與大麥HvNud 的同源性更高。

2.4 AsNud 基因的轉(zhuǎn)錄分析

將CIav2921 和CIav9008 種子蠟熟期時(shí)花序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，基于RNA-Seq 數(shù)據(jù)，分析了AsNud1與AsNud2 在2 個(gè)材料中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示（圖4），AsNud1 在2 個(gè)材料中都有表達(dá)，在CIav2921中的表達(dá)量（RPKM 值0.76）低于在CIav9008 中的表達(dá)量（RPKM 值1.34），但差異未達(dá)顯著水平。AsNud2 在2 個(gè)材料中也都有表達(dá)，在CIav2921 中的表達(dá)量（RPKM 值4.46）顯著高于在CIav9008 中的表達(dá)量（RPKM值0.65）。

3 結(jié)論與討論

AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子是一個(gè)數(shù)目龐大的家族，因含有高度保守的AP2/ERF DNA 結(jié)合域而得名[11]。AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子至少含有一個(gè)名為AP2 結(jié)構(gòu)域的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，是由約60 個(gè)氨基酸殘基按照3 個(gè)β 折疊和1 個(gè)α 螺旋的方式所構(gòu)成的一個(gè)典型的三維結(jié)構(gòu)[12]。本研究利用大麥中的AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族中的HvNud 基因?yàn)榉N子序列，采用電子克隆的方式，從二倍體皮、裸燕麥中克隆到2 條同源序列，序列分析發(fā)現(xiàn)，AsNud1、AsNud2 和HvNud 一樣，都存在由大約68 個(gè)保守殘基組成的被稱為AP2 結(jié)構(gòu)域的DNA 結(jié)合基序[13]，因此，本試驗(yàn)克隆到的AsNud1 和AsNud2 都屬于AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族。此外，AsNud1 和AsNud2 還存在另外2 個(gè)保守的中間基序（mm）、C 末端基序（cm），這2個(gè)保守基序也同樣存在于HvNud 基因中[5]。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，對(duì)基因的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，AsNud 基因與大麥的HvNud 基因具有相同的基因結(jié)構(gòu)，都是由2 個(gè)外顯子和1 個(gè)內(nèi)含子組成。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，AsNud 基因與大麥的HvNud 基因、擬南芥的WIN1/SHN1、水稻的Os02ERF 和Os06ERF、玉米的Zm2g085678 親緣關(guān)系最近。相比AsNud1，AsNud2與HvNud 的關(guān)系更近。對(duì)AsNud1 和AsNud2 序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，二者的相似性達(dá)到77%，因此，二者為旁系同源基因。

AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子是植物中廣泛存在且特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆反應(yīng)等生命過(guò)程。第一個(gè)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子基因在模式植物擬南芥中被分離出來(lái)，且被證實(shí)參與了花發(fā)育過(guò)程的調(diào)控[13]。其他植物中的AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子也有陸續(xù)報(bào)道。本研究中克隆到的AsNud 基因，其同源基因在水稻中影響水稻的木質(zhì)素含量，是轉(zhuǎn)錄抑制子，該基因可能參與植物次生細(xì)胞壁的生物學(xué)過(guò)程[9]，這與皮燕麥外稃堅(jiān)硬且木質(zhì)素含量高、裸燕麥外稃柔軟且木質(zhì)素含量低對(duì)應(yīng)一致；該基因還與擬南芥SHN/WIN 轉(zhuǎn)錄因子家族基因同源，擬南芥SHN/WIN 轉(zhuǎn)錄因子家族與蠟質(zhì)和角質(zhì)合成調(diào)控有關(guān)[8]，這與皮燕麥外稃平滑有光澤、裸燕麥外稃不平滑無(wú)光澤對(duì)應(yīng)一致；該基因在大麥中控制大麥的皮裸性[5]。燕麥籽粒的皮裸性與大麥有相似之處又有所不同。成熟后的皮燕麥外稃質(zhì)地堅(jiān)硬，與籽粒緊密相連，不易與籽粒分離，而裸燕麥外稃質(zhì)地柔軟，容易與籽粒分離，這點(diǎn)與大麥皮裸性相似，即裸大麥外稃較皮大麥外稃更易與籽粒分離。大麥開花10 d 后，皮大麥的穎果表面會(huì)出現(xiàn)一種黏性物質(zhì)，將穎果與外稃黏附在一起[14]。大麥皮裸性由位于染色體7HL 上的單個(gè)基因位點(diǎn)（nud）控制[15]，裸大麥與皮大麥相比，缺失固定的17 kb ERF 基因。而在燕麥中，皮、裸燕麥雖然不存在這種缺失，但皮燕麥（CIav2921）較裸燕麥（CIav9008）會(huì)提前終止編碼。本研究表明，這種差別可能與籽粒的皮裸性相關(guān)，同時(shí)可以推測(cè)大麥與燕麥中控制皮裸性的機(jī)制不完全一致。對(duì)AsNud 基因的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，AsNud1和AsNud2 在CIav2921（皮）和CIav9008（裸）的花器官中都有表達(dá)，但表達(dá)模式不同，其中，AsNud1在CIav2921 中的表達(dá)量低于在CIav9008 中的表達(dá)量，但差異未達(dá)顯著水平；而AsNud2 在CIav2921中的表達(dá)量顯著高于在CIav9008 中的表達(dá)量。這種旁系同源基因表達(dá)模式的差異在多種植物中都有報(bào)道[16-19]。此外，AsNud2 在CIav2921 和CIav9008 燕麥中的表達(dá)有明顯的差異，說(shuō)明AsNud2 基因的調(diào)控區(qū)或上游的調(diào)控因子在該皮、裸燕麥中出現(xiàn)了差異，這可能是導(dǎo)致這2 個(gè)材料籽粒皮裸性不同的另一個(gè)原因。