耐除草劑玉米MON87427 定性PCR 檢測方法的建立

吳博澤，劉 璇，郭俊佩，許冬梅，袁建琴，高建華，史宗勇

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

2018 年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積1.917 億hm2，其中，轉(zhuǎn)基因玉米約占30%[1]。轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)誕生以來，生物安全問題相伴而生，不同國家和地區(qū)采取各具特色的轉(zhuǎn)基因生物安全管理制度，以確保人類、植物、動物、微生物和生態(tài)環(huán)境安全[2]。我國采取積極的應(yīng)對措施，制訂了一系列法律法規(guī)對其進(jìn)行嚴(yán)格管理。為實(shí)現(xiàn)有效監(jiān)管，必須對相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品建立精準(zhǔn)檢測方法。目前，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法主要集中在核酸檢測和蛋白質(zhì)檢測2 個方面[3]。其中，核酸檢測主要針對外源插入序列中的特殊元件或者插入序列附近的特征序列。通常，轉(zhuǎn)化體特異性檢測的靶標(biāo)主要是外源插入序列與靶標(biāo)物質(zhì)基因組連接區(qū)域的DNA 序列。這種方法具有高度的專一性，是轉(zhuǎn)化體特異性檢測的首選方法[4]。

在眾多轉(zhuǎn)基因作物中，耐除草劑性狀的轉(zhuǎn)化體推廣面積最廣，比如，2018 年，耐除草劑性狀轉(zhuǎn)基因作物約占全球轉(zhuǎn)基因作物推廣面積的46%。目前主要的耐除草劑基因是epsps 和bar。耐除草劑玉米MON87427 是孟山都公司研發(fā)的耐草甘膦的轉(zhuǎn)基因品系，插入的外源序列包含一個根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens CP4）epsps 基因的表達(dá)框[5]。該基因編碼一種5- 烯醇式丙酮酰- 莽草酸-3- 磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synt hase，EPSPS），該酶對除草劑草甘膦表現(xiàn)出極高的耐受性，常被用作轉(zhuǎn)基因耐草甘膦性狀的篩選標(biāo)記[6-9]。在MON87427 中，該基因由花椰菜花葉病毒CaMV 35S 啟動子和NOS 終止子調(diào)控表達(dá)。

據(jù)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用國際服務(wù)組織（ISAAA）統(tǒng)計，MON87427 在全球18 個國家已授權(quán)食用或飼用，在美國、加拿大等4 個國家已授權(quán)批準(zhǔn)種植。目前，我國也已經(jīng)批準(zhǔn)該轉(zhuǎn)化體產(chǎn)品的進(jìn)口。因此，對該轉(zhuǎn)化體在進(jìn)口過程中的檢驗(yàn)檢測和進(jìn)入國內(nèi)市場后的監(jiān)督管理顯得尤為重要和迫切。

本研究以耐除草劑玉米MON87427 轉(zhuǎn)化體特異性序列為依據(jù)，建立轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR 檢測方法，并對該方法的特異性、靈敏度、重復(fù)性進(jìn)行測試，旨在為對該轉(zhuǎn)化體的安全評價、行政監(jiān)管提供重要的技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

耐除草劑玉米MON87427、耐除草劑玉米MON87427 受體材料由孟山都公司研發(fā)，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心提供相應(yīng)的籽粒粉末。

其他轉(zhuǎn)基因玉米混合樣品，包含Bt176、Bt11、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、59122、MIR604、MON88017 和MON810 等12 種轉(zhuǎn)基因玉米，每種轉(zhuǎn)基因玉米質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%；轉(zhuǎn)基因大豆混合樣品，包含305423、CV127、MON89788、A5547-127、A2704-12、GTS40-3-2、305423×GTS40-3-2 等7 種轉(zhuǎn)基因大豆，每種轉(zhuǎn)基因大豆質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%；轉(zhuǎn)基因棉花混合樣品包含LLCOTTON25、MON531、MON1445、MON15985 和MON88913 等5 種轉(zhuǎn)基因棉花，每種轉(zhuǎn)基因棉花質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%；轉(zhuǎn)基因油菜混合樣品，包含MS1、MS8、GT73、RF1、RF2、RF3、T45、Topas19/2 和Oxy235 等9 種轉(zhuǎn)基因油菜，每種轉(zhuǎn)基因油菜質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%；轉(zhuǎn)基因水稻混合樣品，包含TT51-1、KF-6、KMD-1、M12、KF-8、KF-2、G6H1 等7 種轉(zhuǎn)基因水稻，每種轉(zhuǎn)基因水稻質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。非轉(zhuǎn)基因玉米樣品為大豐30。這些材料均為籽粒粉末，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)作物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（太原）提供。

1.2 試劑

本研究使用的主要分子生物學(xué)試劑為Taq DNA 聚合酶及其配套試劑，包括buffer、dNTPs 等，還有核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000 DNA Marker（寶生物工程（大連）有限公司）；其他生化試劑包括CTAB、Tris、EDTA、瓊脂糖和無機(jī)鹽等（北京言必信科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計與篩選 使用Primer 5.0 軟件，根據(jù)耐除草劑玉米MON87427 的T-DNA 序列插入位點(diǎn)5′端旁側(cè)序列設(shè)計8 條引物（正反各4 條），共16對引物組合（表1）。

采用16 對引物組合，每個組合設(shè)置2 個平行，按農(nóng)業(yè)部1485 號公告-4-2010 規(guī)定[10]，提取質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的MON87427 基因組DNA，檢測DNA 質(zhì)量和濃度，并將DNA 稀釋到50 ng/μL 備用。

采用25 μL PCR 擴(kuò)增體系：模板DNA 1.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，25.0 mmol/L MgCl21.5 μL，各2.5 mmol/LdNTPs2.0 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，1 U/μL Taq DNA 聚合酶1 μL，加ddH2O 至總反應(yīng)體積25 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35 次循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

表1 設(shè)計引物信息

1.3.2 退火溫度和引物濃度優(yōu)化 針對MON87427玉米候選引物，選擇56、58、60、62、64 ℃共5 個退火溫度和0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L 等4 個引物濃度，對PCR 反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3 特異性和靈敏度測試 為測試本研究建立的檢測方法特異性，設(shè)置空白對照；陰性對照，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的MON87427 受體玉米；陽性對照，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的MON87427 玉米；利用篩選出來的候選引物，對1.1 中其他轉(zhuǎn)基因玉米混合樣品、轉(zhuǎn)基因大豆混合樣品、轉(zhuǎn)基因水稻混合樣品、轉(zhuǎn)基因棉花混合樣品、轉(zhuǎn)基因油菜混合樣品、非轉(zhuǎn)基因玉米樣品進(jìn)行PCR 檢測，確定該引物的特異性。

將MON87427 玉米與對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因受體玉米按質(zhì)量比混合制成MON87427 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%的混合樣品，用以確定檢測方法的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果

對16 對引物組合進(jìn)行初篩，結(jié)果顯示，F(xiàn)A/RA（446 bp）、FA/RB（503 bp）、FA/RC（543 bp）、FA/RD（554 bp）、FB/RC（406 bp）和FB/RD（417 bp）組合擴(kuò)增結(jié)果較為理想，可作為候選引物，進(jìn)一步優(yōu)化和篩選（圖1）。

使用上述6 個引物組合，對不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的MON87427 玉米DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，引物組合FA/RC 的特異性和靈敏度均優(yōu)于其他組合（圖2）。因此，本研究將對該引物組合進(jìn)行PCR 反應(yīng)條件和體系的優(yōu)化。

2.2 退火溫度和引物濃度優(yōu)化結(jié)果

對引物組合FA/RC 進(jìn)行退火溫度和引物濃度 優(yōu)化，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因MON87427 玉米成分在設(shè)定條件下（引物濃度0 μmol/L 除外）均有預(yù)期擴(kuò)增，但不同條件對轉(zhuǎn)基因的擴(kuò)增效果存在差別，其中，0.4 μmol/L 引物濃度、58 ℃退火溫度擴(kuò)增的效果最佳（圖3），以此初步建立了耐除草劑玉米MON87427轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法。

2.3 特異性測試結(jié)果

對建立的MON87427 玉米普通PCR 定性檢測方法進(jìn)行特異性測試。結(jié)果顯示，僅從質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的MON87427 玉米混合物樣品中擴(kuò)增出預(yù)期DNA條帶，而在其他樣品中均未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶（圖4）。結(jié)果表明，建立的MON87427 玉米檢測方法具有高度特異性。另外，該方法能夠在MON87427 玉米質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥0.05%的混合樣品中穩(wěn)定擴(kuò)增出預(yù)期DNA 片段，表明該方法具有較高的靈敏度且重現(xiàn)性良好（圖5）。

3 結(jié)論與討論

本研究建立了MON87427 玉米轉(zhuǎn)化體特異性的定性PCR 檢測方法，該方法涉及的技術(shù)參數(shù)符合我國轉(zhuǎn)基因生物安全管理通用技術(shù)要求，能夠高效、精準(zhǔn)檢測轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米MON87427，具有廣泛的實(shí)用性和良好的應(yīng)用前景。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積持續(xù)增長，公眾對轉(zhuǎn)基因生物安全性日益關(guān)注。相應(yīng)轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)也迅速帶動發(fā)展轉(zhuǎn)基因作物檢測方法的研發(fā)，對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品實(shí)行安全評價、產(chǎn)品標(biāo)識、生產(chǎn)許可、經(jīng)營許可、進(jìn)口許可、加工許可等制度的實(shí)施提供了重要技術(shù)支撐[10-12]。

轉(zhuǎn)基因玉米成分檢測對于玉米品種鑒定和對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行有效規(guī)范管理具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[13]。在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測過程中，PCR 技術(shù)因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好，檢測成本較低的特性應(yīng)用最為廣泛[14-17]。其中，轉(zhuǎn)化體特異性PCR 檢測方法以轉(zhuǎn)基因作物的旁側(cè)序列（與外源插入片段連接的受體基因組序列）與外源插入片段的連接即轉(zhuǎn)化體特異序列為檢測靶標(biāo)，具有較高的特異性，是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測國際通用方法之一[18]。