我國柑橘主要病毒類病害及其脫毒技術研究進展

李月　張志標　周玉蓉　鐘進良　劉蕊

摘 要：該文分析了柑橘黃龍病、裂皮病、衰退病及碎葉病的病原及其對柑橘生產(chǎn)的危害，并概述了柑橘脫毒技術的研究進展。

關鍵詞：柑橘;病毒病;脫毒技術

中圖分類號 S436.66文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）08-0080-03

Abstract：Pathogen characters and the harmfulness to citrus production of citrus virus and virus-like disease，including Citrus Huanglongbing，Citrus Exocortis Viroid ，Citrus Tristeza Virus and Citrus Tatter Leaf Virus，are described briefly. Recent progress on citrus virus-free? techniques are summarized.

Key words：Citrus;Virus diseases;Anti-virus technology

柑橘是我國重要的經(jīng)濟作物之一，近5年來我國柑橘產(chǎn)業(yè)一直保持著穩(wěn)步發(fā)展的勢頭，種植面積與產(chǎn)量均穩(wěn)步增長[1-2]。但隨著柑橘種植面積的不斷擴大，病害問題也接踵而至。柑橘極易感染一種或多種病毒類病害，導致植株生長發(fā)育受阻、產(chǎn)量降低、果品品質(zhì)變劣，嚴重者甚至導致植株死亡[2-3]。柑橘病毒類病害主要由病毒和類似病毒引起，即由病毒、類病毒、螺旋體和植原體等病原引起的[4]。目前，世界上已報道的柑橘病毒和類似病毒病約有80余種，多具有易傳播、危害性大、多種病原復合侵染率高、感染后樹體終身帶毒和難以防治等特點[4-5]。我國較常見且對柑橘生產(chǎn)危害較大的病毒類病害主要有柑橘黃龍病、裂皮病、衰退病和碎葉病等。這些病害均可通過苗木轉運和芽條嫁接引種進行遠距離傳播，同時還能在田間通過農(nóng)事操作和昆蟲等進行近距離擴散。目前，針對柑橘病毒類病害尚無有效的防治措施，只能通過嚴格檢疫、對本地良種進行脫毒處理、建立無病毒苗木繁育和推廣體系、對已有疑似感染果樹進行檢測，并對病株進行鏟除等手段進行防控。為此，本文就我國常見柑橘病毒類病害的病原性質(zhì)、癥狀表現(xiàn)及脫毒技術的研究現(xiàn)狀進行了概述，以供參考。

1 我國柑橘主要病毒類病害

1.1 柑橘黃龍?。–irtus Huanglongbing，HLB） 柑橘黃龍病病原最初被判斷為病毒[6-7]，之后廣西柑橘黃龍病研究小組通過四環(huán)素試驗間接證明黃龍病病原不是病毒而是類菌原體[8-9]。有研究者通過電鏡觀察以及青霉素試驗認為黃龍病病原為類立克次氏體[10-12]。近年來，隨著分子生物學技術的發(fā)展，通過對黃龍病病原的16S rDNA測序比對后證實黃龍病的病原菌是細菌[13-14]。柑橘黃龍病病原菌屬韌皮部桿菌屬（Candidatus Liberobacter），根據(jù)其16S rDNA的相似性可分為亞洲種（Candidatus Liberibacter asiaticus）、非洲種（Candidatus Liberibacter africanus）和美洲種（Candidatus Liberibacter americanus）[14-16]。我國的柑橘黃龍病病原菌屬亞州種，其傳播方式主要為柑橘木虱傳播、嫁接傳播以及運輸傳播。柑橘黃龍病在田間的癥狀十分復雜，常見癥狀為葉片斑駁黃化、新梢均勻黃化、缺素型黃化、紅鼻子果等，其中典型癥狀為葉片斑駁黃化。目前，國內(nèi)外檢測柑橘黃龍病的常用診斷方法為PCR檢測方法[17]。

1.2 柑橘裂皮?。–itrus Exocortis Viroid，CEVd） 柑橘裂皮病是由柑橘裂皮類病毒引起的，屬馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒科馬鈴薯紡錘形類塊莖病毒屬，分強毒株系和弱毒株系[18]。CEVd類病毒為低分子量RNA，不編碼蛋白，RNA以線狀和共價閉合環(huán)狀2種分子形式共同存在于寄主體內(nèi)[19]。由于CEVd具有棍棒狀二級結構，鈍化溫度高，110℃下保持15min后仍具有侵染力，直至140℃其感染力才呈線性下降[20]。CEVd可感染多個柑橘種和品種，以枳殼及其雜種作砧木的柑橘易感，癥狀表現(xiàn)為砧木部分樹皮縱向開裂、翹起、剝落、流膠，樹冠矮化，樹勢生長變?nèi)酰Ｍㄟ^苗木的轉運和嫁接進行傳播。目前，我國建立了sPAGE、RT-PCR、斑點雜交、組織印跡雜交等一套完整的檢測體系，為CEVd的檢測和監(jiān)控提供參考依據(jù)[21]。

1.3 柑橘衰退?。–itrus Tristeza Virus，CTV） 柑橘衰退病由柑橘衰退病毒引起，屬長線性病毒科（Closteroviridae）長線性病毒屬（Closterovirus），其基因組由單鏈正義RNA （ssRNA）組成，含19296個核苷酸，是已知植物病毒中基因組最大的病毒，外殼蛋白分子量為25kDa[22，23]。衰退病毒根據(jù)其癥狀表現(xiàn)可分為以下3種類型：速衰型（quick decline，QD），引起植株逐漸或快速的衰退或死亡;莖陷點型（stem pitting，SP），引起感染植株莖枝木質(zhì)部出現(xiàn)凹陷點或溝，同時導致樹體矮化、樹勢衰弱、生長遲鈍等;苗黃型（seedling yellow，SY），引起植株葉片黃化。其中，速衰型和莖陷點型的株系為強毒系，苗黃型的株系為弱毒系，可用一些弱毒株系通過交叉保護的方式防治強毒株系的危害[24]。柑橘衰退病除通過嫁接傳播外，在田間還可通過橘蚜、棉蚜、橘聲蚜、桃蚜和繡線橘蚜傳播，其中橘蚜傳毒能力最強[25]。

1.4 柑橘碎葉病（Citrus Tatter Leaf Virus，CTLV） 柑橘碎葉病最初在北京檸檬和溫州蜜柑上被發(fā)現(xiàn)，主要通過汁液進行傳播，嫁接工具是其主要傳播途徑，遠距離傳播則是帶毒苗木和接穗，目前尚未發(fā)現(xiàn)昆蟲傳播[4]。CTLV屬發(fā)狀病毒科（Capilloviridea）發(fā)狀病毒屬（Capillovirus）單鏈正義RNA（ssRNA）病毒，呈彎曲線狀顆粒，大?。?00～700nm）×（13～15nm），基因組包含6496個核苷酸，蛋白外殼的分子量為27kDa。此外，具有3′端的poly（A）尾巴和2個開放閱讀框ORF1和ORF2，分別編碼242kDa前體蛋白和36kDa運動蛋白[26-27]。該病毒寄主范圍廣，能夠感染多個柑橘品種。我國枳殼砧的寬皮柑橘類品種發(fā)病較重，常見癥狀為砧穗結合部位腫大并形成明顯的黃色環(huán)，植株葉片碎小缺損，樹勢衰弱甚至死亡。

2 柑橘病毒脫毒技術

2.1 熱處理及化學處理脫毒 熱處理脫毒法是最早和最普遍的果樹脫毒處理方法之一，其利用病毒不耐高溫的特點，通過加熱使植株中的病毒鈍化失活，從而起到脫除病毒的作用。由于不同種類病毒的熱抗性不同，常使用35～40℃的溫度范圍進行熱處理[28]。通常熱處理對線狀病毒、類細菌、類菌質(zhì)體等引起的病害有效，而對耐熱性高的類病毒如裂皮病病毒等則沒有效果[29]。常用的熱處理方法有熱水處理法和濕熱空氣處理法。熱水處理法對休眠器官或離體接穗的效果較好，通常將待處理部分浸泡50℃左右的熱水中，一定時間后剝?nèi)∑湫菝哐窟M行接種;濕熱空氣法則對生長活躍的莖尖效果較好，通常是將待處理部分置于35～40℃下處理一定時間，可采用晝夜交替、低溫交替或隔日高溫的形式進行[28，30]。對于不同病原菌及不同的植株，采用合適的處理時間與溫度是熱處理法成功的關鍵?；瘜W處理脫毒多采用化學藥品進行處理，如嘌呤嘧啶類似物、抗生素、氨基酸等，其作用是抑制植株內(nèi)病毒的復制，目前柑橘上常用的是四環(huán)素[31]。有研究發(fā)現(xiàn)，對黃龍病病原的脫除，加熱與四環(huán)素相結合進行處理，較單獨進行熱處理或四環(huán)素處理的效果要好[12]。

2.2 莖尖培養(yǎng)脫毒 莖尖培養(yǎng)脫毒法的依據(jù)是：病毒通過植物維管束和胞間連絲進行傳播，而植物分生區(qū)尤其是莖尖生長點（約0.1～0.5mm區(qū)域）無維管束，且細胞分裂增殖速度較病毒擴散速度快，因此莖尖生長點含毒量極低，切取這類微小的無病毒組織進行培養(yǎng)即可獲得無病毒植株[4]。一般情況，切取的莖尖越小，脫毒效果越好，但隨著剝?nèi)〉慕M織越小，其成活率會降低，因此，對于不同的植株需要選擇合適的莖尖大小，以保證較好的脫毒效果和較高的成活率。

2.3 莖尖嫁接脫毒 由于莖尖培養(yǎng)脫毒法所取莖尖組織微小，不易培養(yǎng)，生根率和移栽成活率均較低，因而衍生出既能利用無毒莖尖組織嫁接，又能解決莖尖培養(yǎng)不易生根和成活的莖尖嫁接脫毒法。該方法于1972年由Murashige等[32]首先提出，1975年Navarro等[33]加以改進，現(xiàn)已成為國內(nèi)外廣泛采用的脫毒方法。國內(nèi)研究也表明，莖尖嫁接可以脫除柑橘黃龍病、柑橘裂皮病等病原體[12，34-35]。影響莖尖嫁接成活的因素有：砧木品種、接穗選取、莖尖大小以及嫁接方法等[36]。由于莖尖嫁接仍然存在因莖尖較小而導致成活率較低，以及對部分病毒如碎葉病等的脫除無效，國內(nèi)外學者使之與熱處理相結合，在莖尖嫁接前通過一定時間和溫度的熱處理即可獲得滿意的脫毒效果，成功脫除出柑橘黃龍病、衰退病、裂皮病、碎葉病及鱗皮病等多種病毒類病害[33，37]。

2.4 其他脫毒方法 除以上脫毒方法外，脫毒途徑還有珠心培養(yǎng)法、超低溫脫毒法、愈傷組織脫毒法等。其中，超低溫脫毒是目前研究的新方向，其原理是：在降低溫度的過程中，細胞因含水量較高，易形成較多冰晶，使得細胞破裂受損而亡，僅有生長點的分生組織能夠存活下來，病原體失去寄主細胞而被脫除。目前，該技術在柑橘脫毒上的應用仍較少，丁芳[38]研究發(fā)現(xiàn)，采用包埋玻璃化法對柑橘莖尖進行超低溫處理，其黃龍病、衰退病以及裂皮病的脫毒率分別達91.6%、90.0%和88.8%。陳毅群等[39]采用超低溫處理與莖尖嫁接相結合對紅江橙、沙田柚、椪柑、北京檸檬和蘿崗甜橙等5個柑橘品種進行黃龍病病原菌的脫毒處理，脫毒率達98.1%。

3 展望

建立柑橘無病毒苗木繁育體系是我國現(xiàn)代柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的趨勢，其中嫁接用莖尖接穗的脫毒處理是影響無病毒苗木成活率的重要因素。莖尖嫁接脫毒法是柑橘苗木中運用最為廣泛的脫毒技術，但是單一的脫毒方法往往無法脫除多種病原菌，為獲得更好的脫毒效果，常采用物化處理與莖尖嫁接相結合的方式，如熱處理與莖尖嫁接相結合，化學藥物處理與莖尖嫁接相結合，以及近年來興起的超低溫處理與莖尖嫁接相結合?？共《巨D基因技術通過基因工程技術在柑橘植株內(nèi)轉入外源抗病毒基因，促使植株可以在體內(nèi)表達對相應病原菌的抗性，也為柑橘無病毒苗木的繁育提供了一條新的途徑。

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（責編：張宏民）