不同濃度NaCl溶液對四川裂腹魚精子活力的影響研究

劉桂蘭　周禮敬　楊林　詹會祥　王朝榮

摘 要：通過開展0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%等不同濃度的NaCl溶液對四川裂腹魚成熟精子活力的影響研究，結(jié)果表明，在NaCl溶液濃度為0.2%～0.8%的范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，精子劇烈運(yùn)動的時間和壽命時長均與NaCl濃度呈正相關(guān);當(dāng)濃度為0.8%時達(dá)到最大值，精子劇烈運(yùn)動時間平均達(dá)35″63，平均壽命78″20;之后隨著NaCl濃度增加，精子劇烈運(yùn)動時間和壽命時長均與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)狀態(tài)。在人工繁殖時用濃度為0.8%NaCl溶液激活精子受精，平均受精率達(dá)到86.57%，比用養(yǎng)殖用水激活精子時的受精率高出22.11%，可大幅度提高四川裂腹魚的人工繁殖受精率。

關(guān)鍵詞：四川裂腹魚;NaCl;精子活力;受精率

中圖分類號 S962.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）08-0067-03

四川裂腹魚（Schizothorax kozlovi）是長江上游特有的魚類[1]，也是產(chǎn)區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)魚類，主要分布在長江上游的烏江、金沙江、雅礱江水系。近年來，受過渡捕撈、水環(huán)境污染、水工建筑等的影響，野生種群數(shù)量及分布區(qū)域急劇減少，漁獲物個體趨于低齡化、小型化、低質(zhì)化。開展該魚類人工繁殖技術(shù)、基礎(chǔ)生物學(xué)特性的研究，已成為業(yè)內(nèi)研究的熱點之一。目前，對四川裂腹魚的研究主要集中在繁殖力[2]、肌肉營養(yǎng)成分[3]、人工繁殖和苗種培育[4]、親魚培育[5]等方面，而關(guān)于其精子活力的研究還尚未見報道。

受精是魚類人工繁殖技術(shù)的關(guān)鍵點之一，如何提高受精率，為養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來更大的經(jīng)濟(jì)效益，已成為水產(chǎn)界的主要研究方向。影響魚類受精率的因素很多[6]，精子活力就是其中之一。用NaCl溶液激活精子活力目前在虹鱒、鯉魚、團(tuán)頭魴、白點鮭、美國大口胭脂魚、光唇魚、半刺厚唇魚、興國紅鯉等魚類[7-13]中應(yīng)用研究較多，而在裂腹魚種類的研究還未見報道。為此，本研究以四川裂腹魚作為試驗材料，觀察不同濃度的NaCl溶液對四川裂腹魚精子活力的影響，篩選使精子劇烈運(yùn)動時間最長、壽命最大時的NaCl溶液濃度，并應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，以期大幅度地提高四川裂腹魚的人工繁殖受精率。

1 材料與方法

1.1 材料 四川裂腹魚雌雄親魚均來自畢節(jié)市鑫有公司雙坪養(yǎng)殖基地水泥池養(yǎng)殖的成熟親魚。NaCl購于山西同杰化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，分析純。用蒸餾水配制不同濃度梯度即0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，對照實驗組為養(yǎng)殖場用水。觀察精子活力時采用三目生物顯微鏡（型號：BM2100）;在體式顯微鏡（型號：ZX-606M）下觀察四川裂腹魚的受精情況。

1.2 方法

1.2.1 采集精液及精子活力的觀察 每次取材時，擦干魚生殖孔周圍的水分，采用頭高尾低的姿勢，由前向后輕壓腹部，將精液擠入事先清潔好的培養(yǎng)皿中，取中段精液觀察，精液要求呈乳白色，無血無糞便污染。將載玻片置于16×40倍的電子顯微鏡下，分別用吸管吸取下列溶液一滴于載玻片上：養(yǎng)殖用水、0.2%NaCl、0.4%NaCl、0.6%NaCl、0.8%NaCl、1.0%NaCl、1.2%NaCl。然后用解剖針挑取少許新鮮精液與玻片上的溶液混合。混合開始后立即采用秒表計時，觀察一個視野，精子活動等級參照吳景貴[14]之標(biāo)準(zhǔn)，即精液與溶液混合開始到75%的精子轉(zhuǎn)為中速運(yùn)動的時間為劇烈運(yùn)動時間，計時起到95%的精子停止運(yùn)動時間為精子的壽命。每個溶液濃度用同一樣本分別做5次平衡實驗，取平均值分別得到精子的劇烈運(yùn)動時間和壽命時間。

1.2.2 人工受精及受精率統(tǒng)計 采用人工干法授精的方式[15]：授精時將雌魚腹部水分擦干，用毛巾包裹雌魚，采用頭高尾低的姿勢，輕壓腹部將卵擠入清潔盆中;隨即用相同手法將雄魚擠出精液，快速攪拌精、卵，使之充分混合。每組隨機(jī)取1份加入500mL養(yǎng)殖用水激活精子，其余部分隨機(jī)分成3份分別用500mL的0.8%NaCl溶液激活精子。激活精子后晃動1～2min，室內(nèi)靜置5min后洗卵。受精率的統(tǒng)計選擇在胚胎發(fā)育到原腸中期時，用小網(wǎng)隨機(jī)撈取魚卵100粒左右放在培養(yǎng)皿中，在體式顯微鏡下觀察，受精率統(tǒng)計參照危起偉等[16]方式進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl溶液對精子活力的影響 記錄在室溫18～20℃下采用不同濃度NaCl溶液激活精子，鏡下觀察記錄精子的劇烈運(yùn)動時間和壽命時間（見表1）。由表1可知：在采用養(yǎng)殖用水激活時，精子的劇烈運(yùn)動時間和壽命時間分別是22″49和62″57;在用0.8%NaCl濃度激活時，精子劇烈運(yùn)動時間和壽命時間均達(dá)到最高值，分別為35″63和78″20。而其他濃度的NaCl溶液對四川裂腹魚精子活力的影響均低于0.8%時。

表1 不同濃度NaCl溶液的精子活力

[NaCl濃度 觀察次數(shù) 劇烈運(yùn)動的平均時間（s） 平均壽命（s） 對照組 5 22″49 62″57 0.2%NaCl 5 17″88 40″82 0.4%NaCl 5 20″58 45″25 0.6%NaCl 5 23″20 70″49 0.8%NaCl 5 35″63 78″20 1.0%NaCl 5 20″82 40″92 1.2%NaCl 5 15″26 25″33 ]

2.2 不同濃度NaCl溶液對受精率的影響 取同批次精卵，在相同環(huán)境條件下，分別用養(yǎng)殖用水和0.8%NaCl溶液激活精子受精，在胚胎發(fā)育到原腸中期時測定受精率，結(jié)果見表2。由表2可知：0.8%NaCl溶液激活下的平均受精率為86.57%，養(yǎng)殖用水激活下的受精率為66.46%。

3 結(jié)論與討論

3.1 精子活力 魚類精子在精巢和精液原漿中是不活動的，當(dāng)遇水或其他可激活物質(zhì)時便開始劇烈活動，隨著時間延續(xù)，其自身儲存能量逐步消耗直至殆盡，生命終止。精液中含有鈉、鉀等金屬元素，鈉是其中主要起穩(wěn)定滲透壓作用元素之一，對精子的激活和抑制有著非常重要的作用[17]。目前，已有大量的研究報道[10-13]指出，精子運(yùn)動時間和壽命，與其所處介質(zhì)的滲透壓環(huán)境有關(guān)，當(dāng)外界滲透壓和其自身滲透壓相一致時，其壽命時間及劇烈運(yùn)動時間達(dá)最大值，低于或高于精子本身的滲透壓，精子的運(yùn)動都會受到不同程度的抑制。

羅芬等[11]通過對寬口光唇魚精子活力的研究，結(jié)果表明，當(dāng)NaCl濃度為0.51%時，其精子的劇烈運(yùn)動時間和壽命最長;張艷萍等[7]通過對虹鱒精子的活力研究，結(jié)果表明，3齡虹鱒精子在0.8%的NaCl溶液中，其精子活力達(dá)到最高，當(dāng)高于此濃度時，精子的活力受到抑制;劉麗麗等[12]對半刺厚唇魚精子活力研究時得出，在NaCl濃度為0.7%時，其精子劇烈運(yùn)動時間和壽命時間都是最長的。本試驗研究了0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%等不同濃度的NaCl溶液激活四川裂腹魚精子時，觀察記錄其精子劇烈運(yùn)動時間和壽命，結(jié)果顯示，在NaCl溶液濃度0.2%～0.8%范圍內(nèi)，隨著濃度升高，精子劇烈運(yùn)動時間和壽命時長均與NaCl濃度呈正相關(guān)狀態(tài)，且濃度為0.8%時達(dá)到最大值，之后隨著NaCl濃度增加，精子劇烈運(yùn)動時間和壽命時長均與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)狀態(tài)。延長精子劇烈運(yùn)動時間在生產(chǎn)中具有實踐意義，在此時間內(nèi)更具有有效的受精能力[18]。因此，在進(jìn)行人工繁殖時，采用0.8%NaCl溶液激活精子，在時間上為四川裂腹魚受精提供了更多機(jī)會，從而提高了受精率。

3.2 受精率 多年研究表明，四川裂腹魚在人工養(yǎng)殖條件下不能自然繁殖，人工繁殖是實現(xiàn)其種群規(guī)模擴(kuò)大、滿足養(yǎng)殖需求的有效方法。已有研究表明，四川裂腹魚在人工繁殖時，采用養(yǎng)殖用水激活精子，其受精率最高僅為75.4%，平均為66.3%。本試驗在人工繁殖時采用濃度為0.8%NaCl溶液激活四川裂腹魚精子，精子劇烈運(yùn)動時間平均達(dá)35″63，平均壽命78″20;而對照試驗用養(yǎng)殖用水激活四川裂腹魚精子時，精子劇烈運(yùn)動時間平均僅為22″49，平均壽命62″57。用濃度為0.8%的NaCl溶液激活四川裂腹魚精子受精，最高受精率達(dá)93.02%，最低受精率83.63%，平均受精率86.57%，明顯高于采用養(yǎng)殖用水激活精子時的受精率。受精率高低除與卵子質(zhì)量有關(guān)外，還與受精時精子劇烈運(yùn)動時間、壽命有關(guān)，劇烈運(yùn)動時間越長，將具有更強(qiáng)的競爭力，受精效果越好。

在常用的K+、Mg2+、Ca2+、Na+、葡萄糖、ATP等因子用于激活魚類精子時獲得更長劇烈運(yùn)動時間及更長壽命周期，是否也適用于四川裂腹魚還有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)編：張宏民）