一種新型阿莫西林-丙磺舒拼合物在小鼠體內的藥代動力學

李 晗，李艷芹，李仲林，陳良柱，方炳虎,*

(1.華南農業(yè)大學 獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642 ；2.廣東溫氏大華農生物科技有限公司，廣東 云浮 527300)

阿莫西林(amoxicillin，AMO)是一種半合成青霉素類抗生素，獸醫(yī)臨床主要用于尿道、呼吸道、皮膚感染等疾病的治療。阿莫西林屬于時間依賴性藥物，但因其在動物體內半衰期短，其在臨床應用中需要多次給藥。肉雞內服給藥15 mg/kg劑量阿莫西林[1]，其消除半衰期為1.8 h，Tmax為0.47 h，Cmax為2.29 mg/L。為減少青霉素類藥物在臨床使用中的給藥次數(shù)，開發(fā)長效緩釋的青霉素類藥物成為了新型青霉素藥物的研究熱點。

丙磺舒(probenecid，PB)又名羧苯磺胺,是苯甲酸的一種衍生物。丙磺舒在體內主要通過腎近曲小管的主動分泌來排泄，又因其脂溶性大，容易被再吸收，故其在體內排泄緩慢。研究表明[2-5]，丙磺舒與青霉素類藥物聯(lián)合使用能抑制青霉素類藥物在腎小管的排泄，延長青霉素藥物的半衰期及其體內作用時間。丙磺舒還會抑制阿莫西林在肝臟和腎臟中的分布[6]。

藥物拼合是將2種藥物或它們的衍生物通過化學鍵合的方式形成具有多結合靶點或多重作用機制的藥物。藥物拼合的方式包括2種：一種是將具有不同作用機制的抗菌藥物通過化學鍵連接，藥物在體內被特定酶水解再釋放出原化合物而發(fā)揮雙重抗菌作用(dual-action)[7]；一種是將具有不同作用靶點的藥物通過化學鍵連接，這種鍵合方式不會被體內酶水解，形成的新的雜合分子或雜合藥物可作為整體與病原的不同靶標結合發(fā)揮其多靶點抗菌作用[8]。被拼合的不同藥物在體內藥代動力學性質上的差異還可改善其藥代動力學性質及降低毒副作用等[7,9]。藥物拼合原理的出現(xiàn)大大縮短了新藥研發(fā)的速度。課題組參考舒他西林[10-11]的合成路線，將丙磺舒和阿莫西林以亞甲基橋連接形成雙酯結構，成功合成出一種新型阿莫西林-丙磺舒拼合物(amoxicillin-probenecid twin drug，命名為AB)，并對其進行了結構確證及含量檢測。拼合物相對分子質量為663.21，為淡黃色固體粉末，易溶于甲醇，微溶于水。

對拼合物進行的的體外模擬代謝試驗表明，其能在小腸酯酶的作用下完全分解成阿莫西林和丙磺舒。本試驗以阿莫西林、阿莫西林/丙磺舒聯(lián)合用藥為對照，研究阿莫西林-丙磺舒拼合物在小鼠體內的比較藥代動力學，為阿莫西林-丙磺舒拼合物的進一步開發(fā)應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑阿莫西林(先秦藥業(yè)，含量為99.6%)；丙磺舒(北京普博欣生物科技有限責任公司生產，含量98.0%)；阿莫西林-丙磺舒拼合物(華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院獸醫(yī)藥理教研室合成，經前期研究結構確證與含量分析，含量為93.19%)；甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純(美國Thermo Fisher公司)；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙酸乙酯、正己烷均為分析純(廣州化學試劑廠)；試驗用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)提供。

1.2 主要儀器超高效液相色譜串聯(lián)質譜儀(UPLC-MS/MS)，配有Agilent 1290型液相色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司)、AB Triple QuadTM 4500型三重四極桿質譜儀(美國Sciex公司)及Analyst 1.6.3軟件(美國應用生物系統(tǒng)公司)。MS 3 basic型多功能振蕩器，德國 IKA 公司。Thermo Multifuge X1R型臺式高速冷凍離心機，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 標準儲備液的制備

1.3.1阿莫西林標準儲備液 精密稱取阿莫西林標準品20.08 mg，用超純水溶解，定容至10 mL，得到質量濃度為 2 g/L的阿莫西林標準溶液。標準儲備液于4℃冰箱保存。

1.3.2拼合物溶液 精密稱取拼合物71.90 mg，以色譜甲醇溶解，定容至20 mL，得到質量濃度為3.35 g/L 的溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 試驗動物昆明小鼠(合格證號SYXK(粵)2018-0087)，體質量18～22 g，廣東省實驗動物中心提供。試驗前禁食12 h，正常供應飲水。

1.5 UPLC-MS/MS條件

1.5.1液相條件 色譜柱：Luna C18(2)100A(150 mm×2 mm，5 μm)；流動相：0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；流速為300 μL/min；柱溫為40℃；進樣量為5 μL，梯度洗脫程序如表1所示。

表1 阿莫西林梯度洗脫程序

1.5.2質譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，多反應監(jiān)測(MRM)模式對阿莫西林進行定量分析。電噴霧電壓(IS)為 5 500 V，離子源溫度(TEM)為 500℃，霧化氣壓力(GS1)為 60 Pa，輔助氣流速(GS2)為 60 L/min，氣簾氣壓力(CUR)為 30 Pa，碰撞室壓力為(CAD)6 Pa。MRM參數(shù)見表2。

表2 阿莫西林及丙磺舒的質譜參數(shù)

注：*代表定量離子

1.6 樣品前處理方法取100 μL小鼠血漿樣品，加入200 μL色譜乙腈，渦旋1 min，10 000 r/min 離心10 min，取上清 150 μL加入 350 μL純水稀釋，混勻，過0.22 μm濾膜，待測。

1.7 方法學評價

1.7.1標準曲線與檢測限、定量限 采用空白基質添加法。取空白小鼠血漿按照1.6的方法處理，將阿莫西林儲備液稀釋，添加至空白基質中，稀釋為1,2,5,10,20,50,100,200,500 μg/L的樣品，上機檢測，以藥物峰面積為縱坐標(Y)，藥物濃度為橫坐標(X)，對其進行線性回歸分析，求標準曲線回歸方程及相關系數(shù)。在此檢測條件下，信噪比S/N≥3定為檢測限，信噪比S/N≥10定為定量限。

1.7.2回收率與精密度 將一定質量濃度的阿莫西林標準儲備液添加到空白血漿，配制成5，25，500 μg/L 的樣品，每個質量濃度5個重復，按照1.6的方法處理后上機，同時制備空白基質添加樣品，采用單點定量法進行分析，求得相對回收率。

將阿莫西林標準儲備液添加到空白血漿配制成5，25，500 μg/L的樣品，每個質量濃度5個重復，連續(xù)做3個批次，按照1.6的方法處理上機，計算日內精密度及日間精密度。

1.8 動物試驗將體質量為18～22 g的昆明小鼠隨機分為3組，每組各72只，將受試樣品及參比試劑分別按照藥物含量換算給藥量，實際給藥量均為阿莫西林20 mg/kg，給藥方式為灌胃給藥。20 mg/kg劑量的阿莫西林，20 mg/kg+13.60 mg/kg劑量的阿莫西林/丙磺舒聯(lián)合用藥(A+B，MA∶MB=1∶1)以及33.36 mg/kg劑量的阿莫西林拼合物(AB)。在給藥后0.083 ，0.166，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8 h進行小鼠眼球摘除采血，每個時間點6個平行。樣品采集完，將離心得到的血漿置于-80℃冰箱保存，待測。

1.9 數(shù)據(jù)處理將試驗得到的血漿樣品按照1.6中的方法處理分析，得到小鼠血漿中的藥物質量濃度。采用winNonlin(Version5.2.1) 軟件的非房室模型對藥物濃度-時間數(shù)據(jù)進行擬合并計算藥動學參數(shù)。

2 結果

2.1 標準曲線在1.5的檢測條件下，阿莫西林在譜圖上能夠呈現(xiàn)較好的峰形(圖1)。阿莫西林的標準曲線為：Y=45.7X+390.41，(R2=0.9983)(圖2)。檢測限為0.05 μg/L，定量限為1 μg/L。

圖1 基質加阿莫西林標準液液相-質譜圖 圖2 阿莫西林標準曲線

2.2 回收率與精密度血漿中阿莫西林添加質量濃度為5，50,500 μg/L時，其平均回收率介于85.32%～97.54%之間，批內精密度介于2.60%～6.09% 之間，批間精密度介于4.81%～7.25%之間，詳見表3。表明方法具有較好的回收率和精密度，滿足定量分析要求。

表3 阿莫西林小鼠血漿中的回收率與精密度 %

2.3 阿莫西林(AMO)、阿莫西林/丙磺舒聯(lián)合用藥(A+B)及阿莫西林-丙磺舒拼合物(AB)在小鼠體內藥代動力學特征按照 20 mg/kg阿莫西林的有效劑量，分別灌胃給藥阿莫西林(AMO)、阿莫西林/丙磺舒(A+B，MA∶MB=1∶1)、以及阿莫西林-丙磺舒拼合物(AB)后，小鼠體內阿莫西林的血藥濃度-時間曲線見圖3。用藥動學軟件winNonlin5.2.1的非房室模型對數(shù)據(jù)進行擬合，其中，阿莫西林-丙磺舒拼合物較聯(lián)合用藥(阿莫西林/丙磺舒)的相對生物利用度(以阿莫西林計)為110.35%。具體藥代動力學參數(shù)見表4。

圖3 小鼠灌等劑量阿莫西林(20 mg/kg)下，阿莫西林(AMO)、阿莫西林/丙磺舒(A+B)和拼合物(AB)血漿中阿莫西林的藥物濃度-時間曲線圖

3 討論

3.1 拼合物與阿莫西林單藥的藥代動力學比較從表3中數(shù)據(jù)看出，該研究中所用阿莫西林-丙磺舒拼合物(AB)的達峰濃度(以阿莫西林計)較高，與阿莫西林單藥差異顯著(P<0.01)，說明拼合物在小鼠體內吸收較好；其次拼合物與阿莫西林的消除半衰期(t1 /2ke)分別為(1.77±0.23 )，(1.04±0.21) h，MRTlast分別為(2.64±0.24)，(1.81±0.11) h，均差異顯著(P<0.01)，說明拼合物在小鼠體內消除更慢，駐留時間更長；同時拼合物的AUClast遠高于阿莫西林單藥，其生物利用度是阿莫西林的198.09%，表明拼合物AB在小鼠體內生物利用度更高。分析原因可能是拼合物在體內慢慢分解為阿莫西林和丙磺舒，丙磺舒通過提高機體對阿莫西林的吸收[12]，提高了Cmax和AUClast；同時，丙磺舒對阿莫西林在腎小管分泌過程中存在競爭性抑制[12-13]，導致分解出的阿莫西林在小鼠體內消除緩慢，t1 /2ke和MRTlast顯著延長。

表4 小鼠灌服等劑量阿莫西林(20 mg/kg)下，阿莫西林單藥(AMO)、阿莫西林/丙磺舒(A+B)和拼合物(AB)血漿中阿莫西林的主要藥代動力學參數(shù)

注：*a，**a表示拼合物與阿莫西林的藥代動力參數(shù)比較的t檢驗結果； *b，**b表示拼合物與阿莫西林/丙磺舒的藥動參數(shù)比較的t檢驗結果，P<0.01差異極顯著(**)，0.010.05 差異不顯著；F表示拼合物的相對生物利用度

3.2 拼合物與阿莫西林/丙磺舒聯(lián)用藥(A+B)的藥代動力學比較由表3可知，拼合物(AB)在小鼠體內的(按阿莫西林計)消除半衰期t1 /2ke為(1.77±0.23) h，AUClast為(11.41±0.75) mg·h/L，比阿莫西林/丙磺舒聯(lián)合用藥(A+B)的t1 /2ke(1.49±0.50) h、AUClast(10.34±0.94 )mg·h/L 顯著增加(0.010.05)，相對生物利用度(F)為110.35%，表明阿莫西林/丙磺舒形成拼合物后，對阿莫西林的影響較大，拼合技術的開發(fā)應用使其達峰時間增加，消除半衰期延長，生物利用度更高。分析其原因可能是因為拼合物的雙酯結構使得其親脂性增加，能夠增加藥物的細胞膜通透性[14-15]，而且羧酸酯酶在動物體內分布廣泛，其對酯鍵有很好的水解作用[16]，本試驗中的阿莫西林-丙磺舒拼合物在羧酸酯酶作用下部分水解成單藥，產生緩慢釋放的效果，同時分解出的丙磺舒也在腎小管產生了競爭性抑制作用，延緩了阿莫西林的消除，提高了阿莫西林的生物利用度。

本試驗對比了阿莫西林林-丙磺舒拼合物、阿莫西林及阿莫西林/丙磺舒聯(lián)合用藥在小鼠體內的藥代動力學，試驗結果進一步驗證了阿莫西林-丙磺舒拼合物在體內可以在酯酶作用下水解成丙磺舒和阿莫西林而共同發(fā)揮藥效，可充分發(fā)揮丙磺舒對阿莫西林的增效作用，顯著增加阿莫西林的生物利用度，延長阿莫西林在體內的作用時間，且與聯(lián)合用藥相比更加長效。這為阿莫西林-丙磺舒拼合物的進一步開發(fā)應用提供了堅實的理論基礎，也為開發(fā)新型青霉素類藥物提供了新的思路。