孔徑對膠原基組織工程真皮支架性能的影響

譚瑾瑜 廖冠睿 譚 妍 曹金成 羅 靜 陳杏歡 祁少海 陳 蕾*

(1.中山大學(xué) 中山醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510080；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 燒傷外科，廣東 廣州 510080)

1 引言

真皮缺損的修復(fù)是臨床治療的難點和組織工程學(xué)研究的重點。膠原基組織工程真皮的構(gòu)建多以多孔支架材料作為載體或以多孔支架材料為主體，目的是對細(xì)胞外基質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行仿生?？讖绞谴祟惒牧系闹匾獏?shù)之一，可以直接或間接地決定支架的孔隙率、孔隙連通性及力學(xué)性能，對細(xì)胞的粘附、滲透、遷移、生長、營養(yǎng)物質(zhì)傳送、血管長入及代謝產(chǎn)物交換有重要的影響。

2 孔徑對組織工程支架物理性能的影響

組織工程支架的物理性能必須與生物體相匹配?，F(xiàn)代組織工程材料的孔徑大小一般可分為三個等級：納米級(<100nm)、微米級(100nm-100μm)、泛微米級(100μm-1mm)?？讖降拇笮≡谝欢ǔ潭壬嫌绊懼Ъ艿臋C(jī)械強(qiáng)度、抗拉強(qiáng)度等物理性能，是決定支架能否與生物體相適應(yīng)的關(guān)鍵因素之一。研究表明泛微米級支架的交聯(lián)密度與其力學(xué)性能呈正相關(guān)關(guān)系。K.F.Leong等發(fā)現(xiàn)孔隙大小在微米級別的支架機(jī)械強(qiáng)度不高，但孔間互連，使材料滲透率保持較高水平[1]——這是決定細(xì)胞能否進(jìn)行代謝活動的關(guān)鍵。

孔徑的均勻性也會對支架的機(jī)械剛度、擴(kuò)散率、滲透率造成顯著影響。壓力作用時，支架會從薄弱處開始斷裂。孔徑的平均差值就成為了衡量支架穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)之一。材料的相鄰孔徑差越大，材料就越容易被破壞，相同的應(yīng)力值下薄弱處一旦開裂，必將引起整個支架的崩塌。此外，不均勻的孔隙互聯(lián)性不高，擴(kuò)散率相對較低，滲透率較低，引起營養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散滯后[2]。

3 孔徑對組織工程支架生物學(xué)性能的影響

細(xì)胞遷移行為在生化刺激、細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用下發(fā)生的。研究表明：過小的孔徑會導(dǎo)致細(xì)胞遷移的不完全，甚至在支架周緣形成包囊，影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和廢物的排泄[3]；而太大的孔徑會使支架的比表面積下降，影響細(xì)胞的粘附和增殖分化。一項采用大小兩種孔徑的支架探究孔徑影響細(xì)胞增殖與分化的實驗表明：小孔徑支架利于細(xì)胞遷移，培養(yǎng)的細(xì)胞初始增殖率較高，但會限制細(xì)胞聚合體的形成，不利于細(xì)胞分化。相反，孔徑較大(141mm)的支架有提高體外骨組織整合和抑制纖維組織生成的潛力，提示具此類孔徑的支架培養(yǎng)細(xì)胞時細(xì)胞分化和聚集程度更高，[4]這可能與大孔徑材料更利于營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的運輸有關(guān)。

4 人真皮細(xì)胞外基質(zhì)的孔徑特點

真皮為表皮下方的致密結(jié)締組織，血管豐富，主要組成成分為成纖維細(xì)胞及其分泌的膠原纖維。研究發(fā)現(xiàn)，人真皮細(xì)胞外基質(zhì)靠近表皮與皮下組織的部分膠原纖維含量比中間層少：表皮-真皮結(jié)合處的膠原纖維占比約為19.26%；結(jié)合處以深至773.55μm以內(nèi)，膠原纖維占比增加到39.97%左右；而在真皮-皮下交界處171.9μm范圍內(nèi)，膠原纖維的占比降至23.07%左右。膠原纖維占比越少，區(qū)域組織的孔隙直徑就越大——提示真皮靠近表皮與皮下組織部分的孔徑大于真皮中間層。Wang等人對人真皮的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞外基質(zhì)的孔隙直徑約為131.2±96.8μm，中間值是95μm，且真皮-表皮結(jié)合處孔隙直徑較小[5]，該結(jié)果證實了人真皮細(xì)胞外基質(zhì)的天然孔徑具有不對稱(三明治夾心樣)的特性，提示根據(jù)皮膚自然結(jié)構(gòu)設(shè)計的梯度材料支架可為深及真皮的創(chuàng)面愈合提供更好的促進(jìn)愈合效果[2]。

5 膠原基組織工程真皮支架的孔徑設(shè)計

膠原是制作支架最常見的材料。Wang等用Ⅰ型膠原蛋白為原料制作不同孔徑的單層支架進(jìn)行體外和體內(nèi)實驗，結(jié)果顯示孔徑為166.9μm的支架降解能力最好，成纖維細(xì)胞的粘附和增殖細(xì)胞數(shù)量最多，而87.7μm的支架細(xì)胞數(shù)量最少。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，孔徑為166.9μm和120.4μm的支架所形成的肉芽組織的厚度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。綜合體外和體內(nèi)實驗的各項指標(biāo)，孔徑為166.9μm的單層支架最優(yōu)。而當(dāng)膠原支架設(shè)計的細(xì)孔為定向垂直于傷口的通道時，孔徑為100μm的支架在幾種傷口愈合參數(shù)中均獲得了良好的效果，但隨著孔徑增大細(xì)胞嫁接率減少，矩陣穩(wěn)定性降低。同時，在動物模型中，孔徑為80μm，100μm，120μm的支架在促進(jìn)體內(nèi)傷口愈合上表現(xiàn)無差異。體內(nèi)實驗中，當(dāng)孔徑范圍在80-120μm時，支架的體內(nèi)穩(wěn)定性和孔徑的大小成負(fù)相關(guān)[6]。

在膠原中加入其它材料制成的支架也有巨大的應(yīng)用潛力。Bonvallet等人用膠原(聚ε-己內(nèi)酯)和靜電紡絲(PCL)制成的支架的最佳孔徑為160μm[7]，體內(nèi)實驗證明，在此孔徑下可加速傷口閉合，同時也保持了足夠的拉伸強(qiáng)度、低收縮性和合適的降解速率等。

另一種最佳孔徑范圍在120-140μm之間的明膠-殼聚糖海綿支架，具有孔結(jié)構(gòu)均勻，高孔隙率(>90%)，高吸水能力(>1500%)，高保水能力(>400%)的特點。生物相容性結(jié)果表明，此海綿支架適合細(xì)胞黏附和增殖并為皮膚創(chuàng)面愈合提供有效的支持和附著。是一個具有適當(dāng)?shù)奈锢硇阅芎蜕锵嗳菪缘牧己媒M織工程真皮材料。

綜合來看，以膠原為主材料的組織工程真皮支架的最適孔徑一般為100-200μm?？讖捷^大的支架能夠更好的提供氧氣和其他營養(yǎng)物質(zhì)，但細(xì)胞的嫁接率會受影響，細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散率會降低。同時，海綿狀支架因其孔結(jié)構(gòu)的均勻性、高孔隙率、孔結(jié)構(gòu)方向的無固定性可以使細(xì)胞更好的在整個支架中增殖遷移，從而在細(xì)胞生長方向的廣泛性上有一定的優(yōu)越性。

6 現(xiàn)存問題與可能的解決方式

目前的研究顯示最佳孔徑并不是絕對的，植入培養(yǎng)的細(xì)胞不同，細(xì)胞培養(yǎng)的階段不同，所用材料不同甚至組織工程皮膚制備工藝的不同所得的最佳孔徑可能不相同。Bruzauskaite等發(fā)現(xiàn)不同組織再生所需的孔徑隨著移植細(xì)胞和再生組織的體積和起源有所不同。平滑肌上皮，神經(jīng)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在50-160μm的孔徑中生長最好，而微血管上皮細(xì)胞要求小于38μm的孔徑[8]。Murphy等研究表明細(xì)胞生長的不同階段所需最佳孔徑不同，支架培養(yǎng)24h和48h時，120μm孔徑出現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)小高峰，提示在細(xì)胞黏附階段小孔徑支架能提供更多可黏附面積因而有利于細(xì)胞黏附，但是在培養(yǎng)7天時，小高峰消失，提示在細(xì)胞增殖長入階段大孔徑更有優(yōu)勢。且孔徑并非越大越好，孔徑增大將導(dǎo)致物理性能的降低[9]。孔隙率從58%上升到80%時，抗壓強(qiáng)度從11.0MPa下降到2.7MPa，該法制造的支架孔隙率在80%左右能更好平衡微孔連通性和物理性能。而孔徑的上限根據(jù)應(yīng)用的不同上限不一，有結(jié)果顯示孔徑從45-150級別增加到300-600級別，抗屈強(qiáng)度卻無明顯變化。綜上所述，組織工程支架的最佳孔徑和孔隙率沒有絕對的定值，特定組織工程支架的最佳孔徑有待結(jié)合其預(yù)期作用，培養(yǎng)的細(xì)胞等條件具體分析，“因地制宜”的最佳孔徑的確能提升組織修復(fù)的效果。

想獲得孔徑最佳的組織工程真皮支架還需要解決制備的問題，傳統(tǒng)的制備工藝如粒子浸出法/溶液澆注，氣體發(fā)泡法，熱致相分離法等無法靈活控制孔徑和支架條寬，存在形成閉孔，孔隙率不高或有機(jī)溶劑使活性因子失活等缺點，靜電紡絲法和快速原型制造技術(shù)或許是未來制備工藝的趨勢。利用3d打印技術(shù)，可以實現(xiàn)更精準(zhǔn)的控制和立體結(jié)構(gòu)制造。靜電紡絲法的纖維排列緊密導(dǎo)致支架的孔徑較小，這限制了它的應(yīng)用范圍，而通過電場分布控制、鹽析法、聚合物析出法等方法為制備大孔徑纖維支架提供了可能?？焖僭椭圃旒夹g(shù)中的3D噴墨打印和3D擠壓打印能夠精確控制物理梯度和生物梯度，以更好地模仿機(jī)體的天然組織結(jié)構(gòu)。兩種方法均通過計算機(jī)輔助的逐層打印方式將生物墨水甚至細(xì)胞打印成支架，不同區(qū)域可以獲得指定的不同的孔徑和孔隙率，甚至可以由不同的生物材料以不同配比組成[11]。但目前可供選擇的生物材料有限，且支架制成后評價支架中細(xì)胞反應(yīng)的方法有所欠缺。

7 結(jié)語

目前，對于不同制作材料、用于不同組織的支架應(yīng)具有的孔徑相關(guān)屬性尚無統(tǒng)一定論。在真皮損傷修復(fù)中，以膠原為主材料的支架的最適孔徑一般為100-200μm，如能根據(jù)不同部位真皮組織的結(jié)構(gòu)特點對材料孔徑進(jìn)行進(jìn)一步精確控制的話，將有望實現(xiàn)對創(chuàng)面更為精準(zhǔn)、高質(zhì)的修復(fù)目標(biāo)。