化膿隱秘桿菌間接免疫熒光方法的建立及應(yīng)用

劉威，何深宏，任紹科，李小燕，楊雪芬，程方俊，周作勇，曹立亭

(1.西南大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460；2.重慶市獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心，重慶 402460)

化膿隱秘桿菌(Trueperella pyogenes)是隱秘桿菌屬(Arcanobacterium)成員中致病力最高的病原菌，寄生在動物的乳房、泌尿生殖道、呼吸道黏膜和胃腸道黏膜上，常與厭氧菌、大腸埃希菌、鏈球菌等混合存在[1–4]。該菌主要通過創(chuàng)傷感染，引起組織器官發(fā)生化膿性病變，嚴(yán)重時發(fā)生膿毒血癥，導(dǎo)致動物死亡[5]。該病還可引起動物流產(chǎn)、子宮炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、乳房炎、肺炎、骨髓炎、不孕不育[6]，給畜牧生產(chǎn)帶來巨大損失，并且難以防控。張素輝等[7]、李章程等[8]多次從重慶地區(qū)患病山羊體內(nèi)分離到化膿隱秘桿菌，表明該菌已在重慶地區(qū)引起了一定的流行，嚴(yán)重影響了山羊的生長性能及經(jīng)濟(jì)效益。

在生產(chǎn)實(shí)際中，常采用金標(biāo)準(zhǔn)分離法和PCR法檢測化膿隱秘桿菌?，F(xiàn)有方法在研究化膿隱秘桿菌的病原特性方面發(fā)揮了重要作用，但在血清學(xué)檢測方面仍沒有重大進(jìn)展[9]。間接免疫熒光技術(shù)是在血清學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，將特異性抗體與抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的不同來源動物的第二抗體與特異性抗體結(jié)合，以此來檢測抗原的分布[10]。間接免疫熒光技術(shù)由于敏感、特異、直觀、檢測快速、可大量操作等優(yōu)點(diǎn)，在組織病理學(xué)、臨床檢驗(yàn)、病原檢測等方面得到廣泛應(yīng)用[11]。本研究中，用從發(fā)病山羊體內(nèi)分離的1株化膿隱秘桿菌 FL–1來制備兔抗化膿隱秘桿菌高免血清，建立檢測化膿隱秘桿菌間接免疫熒光方法(indirect immunofluorescence assay，IFA)，旨在為化膿隱秘桿菌感染的臨床診斷、感染動物體內(nèi)的化膿隱秘桿菌抗原定位和動態(tài)分布提供有效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料

從患病山羊體內(nèi)分離得到的化膿隱秘桿菌FL–1株(登錄號為KX462008)、偽結(jié)核棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌、大腸埃希菌、沙門氏菌等，由西南大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室鑒定和保存；羊抗兔IgG–FITC購自美國KPL；DAPI(4,6–二脒基–2–苯基吲哚)和脫脂奶粉購自生工生物工程(上海)股份有限公司；牛血清白蛋白(BSA)購自Genview；正電荷粘附玻片購自江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司；2.0～2.5 kg新西蘭白兔和6周齡昆明系小鼠購自西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物科。

1.2 化膿隱秘桿菌高免血清的制備

用McFarland比濁管調(diào)整化膿隱秘桿菌懸液濃度約為1×1010cfu/mL，用甲醛滅活后，作為抗原使用。經(jīng)兔的耳靜脈注射抗原0.3 mL(首免)，7、14、21、28 d后進(jìn)行二免、三免、四免、五免，分別經(jīng)耳靜脈注射0.5、1.0、1.5、2.0 mL抗原，五免后第7天經(jīng)耳靜脈注射抗原2.0 mL，加強(qiáng)免疫。最后1次免疫14 d后，經(jīng)耳靜脈采血檢測，試管凝集試驗(yàn)測兔血清效價達(dá) 1∶640以上時，停止動物進(jìn)食，進(jìn)行心臟采血，分離血清，再經(jīng)56 ℃水浴10 min去除血清內(nèi)的補(bǔ)體，分裝，備用。

1.3 化膿隱秘桿菌抗原片制備

取1 mL化膿隱秘桿菌菌液(菌液濃度為8×108cfu/mL) 12 000 r/min 離心10 min，收集沉淀，棄去上清液，加入1 mL 0.9%NaCl溶液，反復(fù)重懸3次，取20 μL滴加到干凈的載玻片上，自然晾干。其他細(xì)菌的抗原片均照此制備。

1.4 IFA的檢測程序

化膿隱秘桿菌抗原片固定后，放入PBS(磷酸緩沖鹽溶液)中水化2 min，用吸水紙將抗原片上殘留的液體擦干，再用封閉液進(jìn)行封閉，傾去抗原片上的封閉液，勿洗；加入按一定比例稀釋的一抗(兔抗化膿隱秘桿菌高免血清)100 μL，濕盒內(nèi)孵育；一抗孵育結(jié)束后，用PBS振蕩洗滌3次，每次5 min，擦干，加入稀釋的二抗(羊抗兔FITC)100 μL，在濕盒內(nèi)避光孵育；孵育結(jié)束后傾去二抗，接著滴加100 μL 1∶200稀釋的DAPI于抗原片上，室溫孵育2 min；DAPI孵育后用PBS避光振蕩洗滌3次，每次5 min，擦干玻片上的液體，滴加90%緩沖甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 IFA檢測條件的優(yōu)化

參照文獻(xiàn)[12]的方法，對以下各因素進(jìn)行間接免疫熒光條件的篩選和優(yōu)化。

1) 固定方法。分別采用甲醇室溫固定1 h、4%多聚甲醛室溫下固定1 h、冷丙酮4 ℃固定30 min，玻片干透后過火焰3次，加強(qiáng)固定。

2) 封閉液。分別采用3%BSA、5%脫脂奶粉、10%山羊血清37 ℃封閉1 h。

3) 洗滌液。分別采用0.01 mol/L pH 7.4 PBS和含有0.05% Tween–20的0.01 mol/L pH 7.4 PBS進(jìn)行洗滌。

4) 抗體稀釋度。用含1%BSA的PBS稀釋一抗，設(shè) 1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶300 共5 個稀釋度，用含1%BSA的PBS稀釋FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗，設(shè) 1∶50、1∶100、1∶150、1∶200共 4個稀釋度，采用棋盤法進(jìn)行稀釋度篩選，根據(jù)特異性熒光信號的強(qiáng)弱確定一抗和二抗稀釋度。

5) 一抗孵育時間。分別在37 ℃下孵育1、2、3、4 h，4 ℃過夜。

6) 二抗的孵育時間。分別在室溫下孵育1、2、3 h。

7) 襯染處理。分別采用草酸銨結(jié)晶紫襯染菌體3 min和不作襯染處理。

1.6 特異性試驗(yàn)

1) 陰性對照。用正常兔血清代替化膿隱秘桿菌高免血清進(jìn)行試驗(yàn)。

2) 吸收試驗(yàn)。用化膿隱秘桿菌菌體與制備的兔抗化膿隱秘桿菌高免血清等量混合，37 ℃孵育4 h，8 000 r/min離心10 min，取上清代替一抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)。

3) 替代試驗(yàn)。用 PBS替代兔抗化膿隱秘桿菌高免血清孵育抗原片。

4) 對其他細(xì)菌的檢測。制作溶血隱秘桿菌、偽結(jié)核棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、豬鏈球菌等細(xì)菌的抗原片，進(jìn)行間接免疫熒光檢測。

5) 標(biāo)本自發(fā)熒光對照。標(biāo)本不加一抗和二抗，只加PBS，緩沖甘油封片。

1.7 敏感性試驗(yàn)

用PBS將化膿隱秘桿菌菌液(菌液濃度為8×108cfu/mL)按 10 倍梯度進(jìn)行稀釋(10–1、10–2、10–3、10–4、10–5、10–6、10–7共 7 個稀釋度)以檢測該 IFA 方法的敏感性，以出現(xiàn)明顯特異性熒光的最大稀釋倍數(shù)的細(xì)菌稀釋度為其檢測的最高靈敏度。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[13]的方法，用不同時間制作的化膿隱秘桿菌抗原片進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，觀察試驗(yàn)結(jié)果是否穩(wěn)定，該方法是否可以重復(fù)。

1.9 應(yīng)用IFA對人工感染化膿隱秘桿菌的小鼠組織進(jìn)行檢測

24只6周齡左右昆明系小鼠分為2組，其中對照組4只，試驗(yàn)組20只。對照組腹腔注射0.2 mL 0.9%NaCl溶液；試驗(yàn)組腹腔注射 0.2 mL濃度為1×109cfu/mL的化膿隱秘桿菌菌液，記錄并觀察小鼠發(fā)病及死亡情況。無菌采集死亡小鼠的心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟5個器官，制作石蠟切片。利用建立的IFA對人工感染化膿隱秘桿菌死亡的小鼠各組織進(jìn)行檢測，同時進(jìn)行特異性試驗(yàn)以保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠。將本試驗(yàn)建立的IFA檢測方法同“金標(biāo)準(zhǔn)”細(xì)菌分離培養(yǎng)法平行用于試驗(yàn)組和對照組的肝組織檢測，比較2種方法的檢出率。

1.10 IFA的臨床應(yīng)用

利用本試驗(yàn)建立的IFA方法對西南大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存的經(jīng)細(xì)菌分離鑒定確診為化膿隱秘桿菌感染的山羊肺臟、脾臟、肝臟、胸腺、腹股溝淋巴結(jié)、肩前淋巴結(jié)等 31份病料進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 IFA檢測條件的優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)優(yōu)化的IFA檢測條件為：1) 用冷丙酮作固定劑，同時過火焰3次加強(qiáng)固定，細(xì)菌菌體形態(tài)完整，不易脫片，且熒光亮度強(qiáng)，背景染色淺；2) 用10%山羊血清作封閉液，37 ℃封閉1 h，可有效降低背景染色，大大減少非特異熒光；3) 含0.05% Tween–20的0.01 mol/L PBS作洗滌液，可提高抗原的暴露程度，增加熒光亮度，減少非特異著色；4)用草酸銨結(jié)晶紫襯染菌體后，化膿隱秘桿菌菌體被染成紫色，更容易在顯微鏡下找到菌體，從而判斷熒光是否特異；5) 采用一抗 1∶50 稀釋，37 ℃孵育 2 h，二抗 1∶100稀釋，37 ℃孵育2 h，DAPI孵育2 min，熒光顯微鏡下可見到短桿狀的化膿隱秘桿菌發(fā)出的特異性綠色熒光，熒光亮度高，背景清晰，非特異熒光著色少，菌體多為單個存在，個別菌體成團(tuán)聚集(圖1–a)，化膿隱秘桿菌經(jīng)DAPI染色后發(fā)出藍(lán)色的熒光(圖1–b)，將同一視野下的熒光染色圖片和DAPI染色圖片用photoshop合并到一起，可見2張圖片高度重合(圖1–c)，證明化膿隱秘桿菌菌體熒光染色良好。

圖1 化膿隱秘桿菌熒光圖片F(xiàn)ig.1 Trueperella pyogenes fluorochrome picture

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

陰性對照(圖1–d)、吸收試驗(yàn)、替代試驗(yàn)(圖1–e)、標(biāo)本自發(fā)試驗(yàn)及對其他細(xì)菌的檢測結(jié)果均未出現(xiàn)特異性熒光，呈陰性。

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

用PBS將化膿隱秘桿菌菌液稀釋到10–7，此時細(xì)菌的濃度為 80 cfu/mL，在熒光顯微鏡下仍可觀察到典型的特異的綠色熒光(圖1–f)。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

如圖1–g、圖1–h、圖1–i所示，重復(fù)性試驗(yàn)的熒光強(qiáng)度未見明顯改變，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)。

2.5 對人工感染化膿隱秘桿菌的小鼠組織檢測的結(jié)果

人工感染化膿隱秘桿菌死亡小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟均能檢測到陽性信號。在心肌纖維之間出現(xiàn)散在分布的強(qiáng)陽性信號(圖2–a)；陽性信號主要分布在肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和細(xì)胞膜表面(圖2–b)；脾臟的白髓區(qū)和紅髓區(qū)均彌散分布著大量強(qiáng)陽性信號(圖2–c)；肺泡腔、肺泡囊和肺泡隔上可見散在分布的強(qiáng)陽性信號(圖2–d)；陽性信號主要集中在腎小管管腔內(nèi)、近曲小管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，腎間質(zhì)內(nèi)也可見大量散在分布的強(qiáng)陽性信號(圖2–e)。心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟陰性對照的特異性試驗(yàn)結(jié)果均未出現(xiàn)特異性熒光(圖2–f、g、h、i、j)，呈陰性。IFA和細(xì)菌分離結(jié)果顯示，20只攻毒小鼠的肝組織均能檢測到化膿隱秘桿菌，而對照組小鼠的肝組織均未能檢測到化膿隱秘桿菌。2種檢測方法的符合率為100%。

圖2 人工感染化膿隱秘桿菌發(fā)病死亡小鼠器官的IFA檢測結(jié)果Fig.2 The results of organs of dead mouses experimentally infected with Trueperella pyogenes using IFA

2.6 IFA的臨床應(yīng)用結(jié)果

用IFA對31份感染化膿隱秘桿菌的山羊病料進(jìn)行檢測，均檢出了化膿隱秘桿菌抗原，檢出率為100%。

3 結(jié)論與討論

本研究建立的間接免疫熒光方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，能夠?qū)乖M(jìn)行精確定位，可避免在采樣過程中因各組織交叉污染而造成檢測結(jié)果的可靠性降低問題，對化膿隱秘桿菌在感染動物組織細(xì)胞中的定位具有良好效果，有利于全面和系統(tǒng)地了解化膿隱秘桿菌的發(fā)病機(jī)理和流行狀況。

影響免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果的因素較多，包括抗體的特異性和濃度、孵育時間、固定液、固定方式、封閉液、抗原修復(fù)方法等，因此，必須要對試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化并設(shè)置相應(yīng)對照，才能保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠[14]。一抗的特異性是免疫熒光試驗(yàn)成功的關(guān)鍵。本研究中，按免疫程序，經(jīng)耳靜脈免疫家兔制備化膿隱秘桿菌高免血清，制作方法簡便；特異性檢測結(jié)果表明，建立的IFA只對化膿隱秘桿菌呈現(xiàn)陽性結(jié)果，說明該一抗(兔抗化膿隱秘桿菌高免血清)具有良好特異性。非特異性著色的消除對試驗(yàn)結(jié)果的判定有重要影響。本研究中用丙酮固定化膿隱秘桿菌抗原片，丙酮本身具有通透作用，便于抗體到達(dá)抗原部位，同時可以除去菌體表面妨礙抗原抗體結(jié)合的類脂，大大降低熒光染色背景，減少非特異性著色。相比丙酮，用多聚甲醛作固定劑時，雖然極少脫片且更易保持細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)，但其容易造成分子間橋連，導(dǎo)致抗原封閉，阻礙抗原抗體結(jié)合，增強(qiáng)非特異性著色，同時會降低細(xì)菌某些組分的抗原性，不利于抗原檢測。在應(yīng)用該方法對小鼠組織及臨床樣本的檢測過程中，選擇用二抗同源血清(10%山羊血清)預(yù)先孵育組織切片，血清中動物自身的抗體能預(yù)先和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，以封閉抗原片和組織切片上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少抗體非特異性結(jié)合[15]；同時在保證理想試驗(yàn)結(jié)果的情況下，盡可能稀釋抗體，減少背景染色，提高特異性熒光亮度。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)一抗稀釋度為1∶50、37 ℃孵育2 h和一抗1∶200稀釋、4 ℃過夜2種處理均獲得了較好的試驗(yàn)結(jié)果，陽性信號強(qiáng)，背景染色低。為節(jié)省時間，采用一抗1∶50稀釋，37 ℃孵育2 h。用本研究建立的IFA方法對小鼠樣本和山羊臨床樣本進(jìn)行檢測，均能檢測到抗原，說明該方法應(yīng)用性良好。