不同產(chǎn)地牛至中香芹酚和麝香草酚含量分析

馬建民 ， 張凡建 ， 段素云

(北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 ， 北京 房山 102442)

牛至(OriganumvulgareL.)為唇形科牛至屬多年生草本植物，分布廣泛。本品性涼，味辛，無(wú)毒，具有清熱解表、利水消腫的功效。主治中暑、感冒、頭痛身痛、急性胃腸炎、腹痛吐瀉、水腫等癥[1]。牛至也是被廣泛研究的植物添加劑[2-4]，具有很大潛力成為抗生素的天然替代品，其主要抗菌成分為香芹酚(Carvacrol)和麝香草酚(Thymol)。本試驗(yàn)建立了牛至有效成分香芹酚和麝香草酚的高效液相色譜分析法，并對(duì)不同產(chǎn)地牛至進(jìn)行了檢測(cè)，為今后牛至的產(chǎn)地選擇提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀(島津LC-16AT)、電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司SQP]、昆山KQ-500DV超聲清洗機(jī)、震蕩器(IKA)、微量移液器等。

1.2 試劑 香芹酚對(duì)照品、麝香草酚對(duì)照品(>99.0%，Macklin公司)；甲醇、乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司)；水為超純水；牛至1，產(chǎn)地廣西，購(gòu)自菩提藥源；牛至2，產(chǎn)地河北，購(gòu)自誠(chéng)信正品藥業(yè)；牛至3，產(chǎn)地浙江，購(gòu)自藥都保健養(yǎng)生堂；牛至4，產(chǎn)地河南，購(gòu)自福衛(wèi)冷背藥材行。

1.3 溶液配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 分別稱取香芹酚和麝香草酚對(duì)照品0.020 0 g，用甲醇定容至10 mL，制得終濃度為2 mg/mL的2種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液 取以上2種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋制備2、10、20、50、100 μg/mL 5 個(gè)系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，存放于4 ℃冰箱。

1.4 色譜條件 色譜柱InertSustain C18(150 mm×2.1 mm，3 μm)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm；流動(dòng)相為乙腈-水(40∶60)；柱溫50 ℃；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.5 牛至預(yù)處理 牛至粉碎，過(guò)4號(hào)篩，稱取1.000 0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)40 min， 放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，上清液用微孔濾膜(0.25 μm)濾過(guò)后上機(jī)檢測(cè)。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 取上述混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.4色譜條件從低濃度到高濃度測(cè)定，將測(cè)得香芹酚和麝香草酚的色譜峰面積(A)和相對(duì)應(yīng)的濃度(C)做直線回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的線性范圍和相關(guān)系數(shù)。

1.7 檢測(cè)限及定量限 以信噪比(S/N≥10)作為定量限，以信噪比(S/N≥3)作為檢測(cè)限。按1.6中所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算香芹酚和麝香草酚檢測(cè)限及定量限。

1.8 精密度和準(zhǔn)確度 不同產(chǎn)地牛至，按1.5中牛至預(yù)處理方法，做5 個(gè)平行樣品，按1.4中色譜條件分析，計(jì)算樣品標(biāo)準(zhǔn)差。不同產(chǎn)地牛至，稱取牛至粉1.000 0 g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入香芹酚和麝香草酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL，從1.5中牛至預(yù)處理方法，精密加甲醇開始進(jìn)行預(yù)處理，按1.4中色譜條件分析，計(jì)算樣品回收率。

2 結(jié)果

2.1 色譜圖 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和牛至樣品色譜圖見圖1、2，香芹酚和麝香草酚完全分離，色譜峰形對(duì)稱。標(biāo)準(zhǔn)圖譜中香芹酚和麝香草酚，出峰時(shí)間分別為10.890 min和12.222 min，保留時(shí)間合理。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖

圖2 牛至樣品色譜圖

2.2 方法學(xué)考察 按1.6～1.8中方法，香芹酚和麝香草酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍、檢測(cè)限和定量限、準(zhǔn)確度和精密度見表1。線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)差和回收率符合要求。

表1 方法學(xué)考察

2.3 不同產(chǎn)地牛至中香芹酚和麝香草酚的含量 購(gòu)買4 個(gè)產(chǎn)地牛至藥材中香芹酚和麝香草酚的含量見表2。河北產(chǎn)牛至中香芹酚含量最高，為0.61 mg/g；廣西產(chǎn)牛至中麝香草酚含量最高，為1.08 mg/g。

3 討論

3.1 牛至預(yù)處理 廣西牛至樣品分別用超聲15、30、45、60 min處理，含量測(cè)定結(jié)果見圖3，由圖3可知，本試驗(yàn)確定超聲時(shí)間為45 min。

3.2 流動(dòng)相選擇 香芹酚與麝香草酚為同分異構(gòu)體，其化學(xué)名稱分別為2-甲基-5-異丙基苯酚和 5-甲基-2-異丙基酚，完全分離困難。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-水時(shí)，甲醇比例過(guò)高，香芹酚和麝香草酚達(dá)不到完全分離，降低甲醇比例，出峰時(shí)間延長(zhǎng)。香芹酚和麝香草酚在乙腈-水的流動(dòng)相中更易分離。本試驗(yàn)采用乙腈-水(40∶60) 進(jìn)行色譜分析，分離度良好，出峰時(shí)間合適。

3.3 不同產(chǎn)地牛至比較 香芹酚和麝香草酚是牛至抗菌作用的有效成分，所以選定香芹酚和麝香草酚為評(píng)價(jià)牛至質(zhì)量的檢測(cè)指標(biāo)。4 個(gè)產(chǎn)地牛至中香芹酚和麝香草酚含量范圍在0.24～0.61、0.28～1.08 mg/g。河北產(chǎn)牛至中香芹酚含量極顯著高于其他地區(qū)。廣西產(chǎn)牛至中麝香草酚含量顯著高于浙江，極顯著高于其他地區(qū)。以香芹酚和麝香草酚含量為判斷依據(jù)，初步認(rèn)為廣西最佳，浙江次之，河南較差。劉紅兵等[5]對(duì)不同產(chǎn)地牛至香芹酚和麝香草酚含量進(jìn)行檢測(cè)，香芹酚含量范圍是0.1～2.9 mg/g，麝香草酚含量范圍是0.1～6.3 mg/g。可見不同產(chǎn)地牛至中香芹酚和麝香草酚含量，存在較大的差異,說(shuō)明牛至的資源品質(zhì)層次不齊。開展牛至藥效研究時(shí)，首先要確保牛至產(chǎn)地，否則會(huì)出現(xiàn)不一致的試驗(yàn)結(jié)果。在使用牛至作為添加劑，可測(cè)定香芹酚和麝香草酚含量來(lái)調(diào)整添加劑量。同時(shí)應(yīng)開展牛至樣品的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)規(guī)范研制，確保牛至原料質(zhì)量穩(wěn)定。