新疆南疆部分規(guī)模牛場(chǎng)犢牛輪狀病毒、冠狀病毒感染情況調(diào)查與基因鑒定

崔 鑫 ， 孟凡艷 ， 魚?，| ， 張迎春 ， 黃 騰 ， 胡建軍

(1. 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 ， 新疆 阿拉爾 843300 ； 2. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師畜牧獸醫(yī)工作站 ， 新疆 阿拉爾 843300)

腹瀉是引起1月齡以內(nèi)犢牛死亡的主要原因，犢牛腹瀉病因極其復(fù)雜，通常引起新生犢牛腹瀉的原因包括非感染性因素(如飼養(yǎng)環(huán)境因素、營(yíng)養(yǎng)因素)和感染性因素(細(xì)菌、病毒和寄生蟲等因素)。牛輪狀病毒(Bovine rotaviru,BRV)和牛冠狀病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是引起1月齡左右的犢牛發(fā)生嚴(yán)重脫水性腹瀉的非細(xì)菌性主要病原體[1]。這2種病毒均通過糞口途徑傳播[2]，并能適宜低溫的生長(zhǎng)環(huán)境，寒冷的季節(jié)可導(dǎo)致病毒的積累，臨床上多以急性發(fā)作的水樣腹瀉為主要特征，病情較重時(shí)出現(xiàn)大量血液糞便、脫水和虛弱，甚至死亡，嚴(yán)重阻礙犢牛的生長(zhǎng)發(fā)育[3]。BCoV引起的疾病臨床過程、組織學(xué)的損傷、腹瀉產(chǎn)生的機(jī)理及發(fā)病犢牛的年齡都與BRV相似，且感染毒力和造成的死亡率均高于BRV[4-5]。這2種病毒常常會(huì)發(fā)生混合感染，造成病牛的臨床癥狀更加嚴(yán)重，當(dāng)繼發(fā)細(xì)菌感染時(shí)，會(huì)出現(xiàn)發(fā)病急、死亡迅速的特點(diǎn)[6-7]。

養(yǎng)牛業(yè)是新疆南疆地區(qū)的重要畜牧產(chǎn)業(yè)之一，犢牛感染BRV、BCoV會(huì)對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。為調(diào)查新疆南疆地區(qū)部分規(guī)?；膛?chǎng)中是否存在這2種病毒的感染，本試驗(yàn)從規(guī)?；膛?chǎng)中采集腹瀉發(fā)病犢牛的糞便樣品，采用ELISA和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)的方法進(jìn)行檢測(cè)、分析，為當(dāng)?shù)匾?guī)?；膛?chǎng)這2種病的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2017年10月—2018年2月，在新疆南疆地區(qū)12個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)共采集1月齡以內(nèi)發(fā)生腹瀉癥狀的犢牛糞便樣品325份，凍存于-20 ℃ 冰箱中備用。

1.1.2 主要試劑 BRV、BCoV抗原雙抗體夾心ELISA試劑盒，購自美國愛德士(IDEXX)生物科技公司；病毒檢測(cè)用RNA提取試劑盒、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit等，均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 每份糞便樣品取0.5 g于1.5 mL滅菌離心管中，加入1 mL生理鹽水旋渦振蕩，8 000 r/min 離心2 min，取上清液100 μL于新的滅菌離心管中，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 BRV和BCoV抗原的ELISA檢測(cè) 通過商品化BRV和BCoV抗原雙抗體夾心ELISA試劑盒，具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 BRV與BCoV的RT-PCR檢測(cè) 經(jīng)BRV和BCoV抗原雙抗體夾心ELISA試劑盒檢測(cè)為陽性的糞便樣本作為RNA提取樣本，按照病毒檢測(cè)用RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行RNA的提取，提取后的RNA于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

BRV、BCoV的PCR擴(kuò)增引物[8](表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 BRV與BCoV的RT-PCR擴(kuò)增引物

BRV的RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)體系(25 μL)：PrimeScrip 1 step Enzyme Mix 0.5 μL，引物各0.5 μL，模板RNA 2.5 μL，2×1 step Buffer 12.5 μL，RNase Free ddH2O 8.5 μL，混勻后瞬時(shí)離心。PCR反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取3.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察結(jié)果。

BCoV的RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)體系(25 μL)：PrimeScrip 1 step Enzyme Mix 0.5 μL，引物各0.5 μL，模板RNA 2.5 μL，2×1 step Buffer 12.5 μL，RNase Free ddH2O 8.5 μL，混勻后瞬時(shí)離心。PCR反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性50 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取3.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.2.4 PCR產(chǎn)物回收及測(cè)序 按照DNA凝膠回收試劑盒說明書回收PCR產(chǎn)物，送至北京金諾銳杰基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 BRV和BCoV抗原的ELISA檢測(cè) 經(jīng)BRV、BCoV抗原雙抗體夾心ELISA試劑盒對(duì)所采集的糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中12個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)中BRV的檢出率為15.38%，BCoV的檢出率為9.54%(見表2)，2種病毒混合感染率為6.67%。

2.2 BRV的RT-PCR檢測(cè) 以樣品的RNA提取產(chǎn)物為模板，BRV引物VP7-1/VP7-2進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增出1 062 bp大小的基因目的片段；再以PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行基因分型鑒定，以引物VP7-1/G5-2、VP7-1/G6-2、VP7-1/G8-2、VP7-1/G9-2、VP7-1/G10-2進(jìn)行半套式RT-PCR，其中僅有引物VP7-1/G10-2擴(kuò)增出715 bp大小的基因目的片段(見圖1)。

2.3 BRVVP7基因核苷酸同源性分析 樣本序列與NCBI下載的15個(gè)參考株序列通過DNASTAR進(jìn)行核苷酸同源性比較(見圖2)。結(jié)果顯示，樣本核苷酸序列與15個(gè)參考毒株的同源性高達(dá)90%以上，與參考株RVA(突尼斯/2014，牛，KX599304.1)和MAR(摩洛哥/2011，牛，KT726335.1)的核苷酸同源性分別為95.1%和95.6%。確定該樣本為牛輪狀病毒A群，命名為BRV-10T。

2.4 BRV-10T 基因分型分析 通過MEGA軟件對(duì)BRV-10T基因與參考株進(jìn)行核苷酸同源性比較(見圖3)。結(jié)果顯示，BRV-10T與15個(gè)參考毒株的同源性高達(dá)75%以上，與參考株15T(伊朗/2011，牛，KM243016.1)、BoRota(加拿大/2009，牛，JX470517.1)、BOV(摩洛哥/2014，牛，KU729666.1)、BRV-2(埃及/2015，牛，KX268317.1)、Cow-tc(美國/1983，牛，LC133552.1)、DQ-75(中國/2008，牛，GU144587.1)、HM26(中國/2008，牛，F(xiàn)J545658.1)、KC-1xUK(美國/2003，牛，HQ844013.1)、MAR(摩洛哥/2011，牛，KT726335.1)、MX001(墨西哥/2006，牛，F(xiàn)J217204.1)、XJX-07(中國/2007，牛，EU828784.1)、ZAF(南非/2009，牛，KP752915.1)的同源性高達(dá)80%以上，同參考株RVA(突尼斯/2014，牛，KX599304.1)的同源性最為相近，達(dá)到94.7%，經(jīng)基因分型確定BRV-10T為BRV G10型。

表2 ELISA檢測(cè)結(jié)果

圖1 BRV的RT-PCR鑒定

2.5 BCoV的RT-PCR檢測(cè) 將ELISA檢測(cè)到的陽性糞便樣品通過RNA的提取后，采用BCoV 的引物BCV-P1/BCV-P2，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到730 bp大小的目的基因片段(見圖4)。

2.6 BCoV的基因核苷酸同源性分析 應(yīng)用DNASTAR軟件，將下載的7個(gè)冠狀病毒科參考株N基因與檢測(cè)的樣本核苷酸序列進(jìn)行核苷酸同源性比較(見圖5)。結(jié)果顯示，該樣本與BCoV參考毒株的N基因核苷酸同源性為96.2%～98.5%，確定該樣本為牛冠狀病毒，命名為BCV-Aks-01株。

3 討論

自20世紀(jì)80年代，我國首次發(fā)現(xiàn)BRV和BCoV后，在我國各個(gè)地區(qū)對(duì)2種病毒的報(bào)道也越來越多。李鑫等[9]對(duì)我國12個(gè)不同地區(qū)的牛血清進(jìn)行了ELISA抗體檢測(cè)，調(diào)查表明，BRV在我國牛群中的感染極為普遍；姜向陽[10]、田風(fēng)林等[11]分別對(duì)陜西省、固原市的部分牛場(chǎng)犢牛進(jìn)行了BRV抗原檢測(cè)。沙金明等[12]、胡傳偉等[13]研究表明，我國青海省及東三省都存在BCoV感染的情況；蔣靜等[14]、劉合義等[15]對(duì)沿海地區(qū)的牛場(chǎng)進(jìn)行了BCoV的抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)BCoV感染率逐年增加，且腹瀉牛群的陽性率明顯高于未腹瀉牛群，表明BRV與BCoV在我國牛群中的感染趨勢(shì)已逐漸蔓延。

在新疆，段新華等[16]采用ELISA的方法對(duì)新疆不同地區(qū)的7個(gè)規(guī)?；?chǎng)進(jìn)行了BRV抗原檢測(cè)，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)的方法對(duì)其進(jìn)行了復(fù)檢，結(jié)果表明：各場(chǎng)陽性率為25%～50%，且PAGE的復(fù)檢符合率為85.7%；俞銀江等[17]運(yùn)用犢牛腹瀉四聯(lián)檢測(cè)試劑盒對(duì)新疆塔城地區(qū)2個(gè)團(tuán)場(chǎng)西門塔爾發(fā)病犢牛的腸內(nèi)容物進(jìn)行BCoV病原檢測(cè)，結(jié)果顯示，陽性率為55.56%，且存在與其他致腹瀉病原的混合感染。

圖2 BRV VP 7基因核苷酸同源性比較(Clustal W)

圖3 BRV-10T基因核苷酸同源性比較(Clustal W)

圖4 BCoV的RT-PCR檢測(cè)

張瑩鈺等[18]、張婉琪等[19]對(duì)新疆南疆BCoV進(jìn)行了病毒分離、基因型鑒定及全基因組序列測(cè)定，本調(diào)查在其試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用輪狀病毒和冠狀病毒抗原雙抗體夾心ELISA的方法對(duì)南疆地區(qū)12個(gè)規(guī)模化牛場(chǎng)進(jìn)行了BRV、BCoV感染情況的調(diào)查，結(jié)果表明：ELISA檢測(cè)到50個(gè)BRV陽性糞便樣品，31個(gè)BCoV陽性糞便樣品，感染率分別為15.38%和9.54%，2種病毒的混合感染率為6.76%；說明南疆部分牛場(chǎng)存在BRV、BCoV的感染且存在混合感染的情況，且輪狀病毒是A群G10型。

圖5 BCV-Aks-01株N基因核苷酸同源性比較(Clustal W)

輪狀病毒根據(jù)其抗原性可分為7個(gè)群，其中A群對(duì)犢牛的感染力最強(qiáng)，通過輪狀病毒VP4和VP7序列分析和比對(duì)，將血清群分為P基因型和G基因型。目前，全球流行的主要牛輪狀病毒為G6、G8和G10型，而我國流行的主要牛輪狀病毒為G6和G10型[20]，常繼濤等[21]從新疆地區(qū)奶牛場(chǎng)的腹瀉糞便樣品中檢測(cè)到輪狀病毒G10型和G6型；而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在新疆南疆規(guī)模化奶牛場(chǎng)中存在A群G10型輪狀病毒感染，與國內(nèi)流行的牛輪狀病毒基因型是一致的。通過本調(diào)查證實(shí)，在新疆南疆部分規(guī)?；膛?chǎng)存在BRV、BCoV感染以及混合感染的情況，為其制定完善的防控措施提供了科學(xué)依據(jù)。