FISH 技術(shù)在乳腺癌HER-2 基因檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值評(píng)估

鞠薇薇

乳腺癌在女性惡性腫瘤發(fā)病率居第一位,且發(fā)病率近年來(lái)逐年提高,發(fā)病群體日益年輕化［1］。原癌基因HER-2 是目前惡性腫瘤研究的重點(diǎn)之一,已有許多文獻(xiàn)報(bào)道指出20%～30%的乳腺浸潤(rùn)癌中有HER-2 基因的過表達(dá)現(xiàn)象［2,3］。HER-2 基因狀態(tài)對(duì)乳腺癌患者的預(yù)后、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、內(nèi)分泌治療、化療、生物靶向治療等均有顯著影響。HER-2 基因是乳腺癌的重要分子標(biāo)志物和治療靶,準(zhǔn)確把握HER-2 基因信息有利于指導(dǎo)臨床醫(yī)師治療［4］。對(duì)此,本研究對(duì)比分析兩種HER-2 基因檢測(cè)方法,探索HER-2 基因檢測(cè)中IHC與FISH 檢測(cè)的一致性,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院婦產(chǎn)科2016 年1 月～2019 年6 月診治的50 例新發(fā)乳腺癌患者作為研究對(duì)象,均為女性,經(jīng)HE 染色制片確診為浸潤(rùn)性乳腺癌,未接受術(shù)前輔助化學(xué)治療等。年齡36～69 歲,平均年齡(54.3±6.1)歲；其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌45 例,浸潤(rùn)性小葉癌5 例。

1.2 方法 經(jīng)手術(shù)切除或粗針穿刺活檢獲取的乳腺癌標(biāo)本分成2 份,分別采用FISH 技術(shù)和IHC 技術(shù)進(jìn)行HER-2 基因檢測(cè)。具體如下。

1.2.1 FISH 技術(shù) 將標(biāo)本切片使用二甲苯脫蠟至水化,然后在室溫下依次采用100%、85%、70%的乙醇梯度脫水,各脫水2 min,然后在去離子水中浸泡30 min,在50℃下浸入30%酸性亞硫酸鈉溶液30 min,使用2×SSC 緩沖液洗片2 次后,將切片置入37℃蛋白酶K溶液中浸泡4～10 min,然后再次洗片后置入0.1 mol/L鹽酸(HCl)中,室溫下浸泡5～10 min。洗片后將切片依次在-20℃的70%、85%、100%乙醇中脫水各2 min,室溫下浸入丙酮2 min,然后在空氣中自然風(fēng)干切片,然后56℃烤片5 min,滴加10 μl 探針混合液到切片上,73℃變性5 min 后在原位雜交儀中雜交,42℃濕盒雜交過夜14～18 h,然后分別使用2×SSC、0.3%、NP-40 洗滌液中洗片,洗去多余的探針,然后在室溫下暗處干燥,滴加10 μl 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)顯色液復(fù)染,蓋玻片后在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 IHC 技術(shù) 標(biāo)本切片常規(guī)脫蠟至水化,將切片置入枸緣酸鈉緩沖液中,微波加熱2 次,5 min/次,修復(fù)抗原,待切片自然冷卻到室溫后,使用PBS 緩沖液洗片3 次,滴加工作濃度的一抗,放入預(yù)熱濕盒中,37℃,60 min,PBS 沖洗；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,37℃下孵化30 min,用PBS 洗脫；滴加100 μl 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液,自來(lái)水沖洗；蘇木素復(fù)染,封片,在鏡下觀察。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察IHC 與FISH 檢測(cè)結(jié)果、FISH檢測(cè)17 號(hào)染色體多體發(fā)生情況。

1.4 結(jié)果判讀 ①IHC：C-erbB-2 陽(yáng)性為+++,>30%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)而完整的細(xì)胞膜著色；可疑為++,陰性為+或0 表達(dá)。(2)FISH：計(jì)數(shù)30 個(gè)細(xì)胞統(tǒng)計(jì)Ratio 值,當(dāng)Ratio 值<1.8 時(shí)為陰性,表示無(wú)HER-2 基因擴(kuò)增；Ratio 值>2.2 時(shí)為陽(yáng)性,存在HER-2 基因擴(kuò)增；Ratio值在1.8～2.2 之間時(shí)可選擇計(jì)數(shù)細(xì)胞100 個(gè)再次統(tǒng)計(jì)Ratio 值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算Kappa 值進(jìn)行一致性檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IHC 與FISH 檢測(cè)結(jié)果 IHC 結(jié)果為+++、++、+/0 時(shí),IHC 與FISH 檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性符合率分別為87.50%、94.59%、20.00%。在IHC 檢測(cè)為+++、++的標(biāo)本中,FISH 檢測(cè)中有93.33%(42/45)顯示為HER-2基因擴(kuò)增；在IHC 檢測(cè)為+/0 的標(biāo)本中,FISH 檢測(cè)中有20.00%(1/5)顯示為HER-2 基因擴(kuò)增。經(jīng)一致性檢驗(yàn),IHC 與FISH 檢測(cè)結(jié)果一致性較好(Kappa 值=0.543,P<0.05)。見表1。

表1 IHC、FISH 檢測(cè)結(jié)果(n,%)

2.2 FISH 檢測(cè)17 號(hào)染色體多體發(fā)生情況 50 例患者中,經(jīng)FISH 檢測(cè)發(fā)現(xiàn),17 號(hào)染色體總多體發(fā)生率為18.00%(9/50),其中在IHC 檢測(cè)HER-2 高表達(dá)(+++、++)患者中的多體發(fā)生率為17.78%(8/45),在HER-2 低表達(dá)或無(wú)表達(dá)(+、0)患者中的多體發(fā)生率為20.00%(1/5),比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.015,P=0.902>0.05)。

3 討論

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性生命健康的惡性腫瘤,其發(fā)病率近年來(lái)逐年提高。HER-2 基因是原位基因,又被稱為C-erbB 基因,其與乳腺癌的發(fā)病、發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)。HER-2 基因的擴(kuò)增表達(dá)檢測(cè)越來(lái)越受到臨床重視,稱為乳腺癌臨床治療、預(yù)后判斷的重要輔助手段［5］。目前臨床上進(jìn)行HER-2 基因檢測(cè)的方法主要是IHC 技術(shù)和FISH 技術(shù),IHC 是以組織為基礎(chǔ)的蛋白檢測(cè)方法,HER-2 基因擴(kuò)增的腫瘤細(xì)胞存在明顯的膜著色,而含有正常HER-2 基因拷貝數(shù)的乳腺癌在不會(huì)有特殊的著色反應(yīng)。IHC 方法操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉、可重復(fù)性好,且對(duì)相關(guān)材料要求不高；但是由于蛋白在標(biāo)本固定、處理過程中易變性破壞等,從而影響檢測(cè)結(jié)果；加上抗體的不同批號(hào)差異以及結(jié)果判斷的主觀性等,使得IHC 技術(shù)在檢測(cè)中易出現(xiàn)假陰性、假陽(yáng)性問題,影響臨床診療［6］。FISH 技術(shù)是一門新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù),其被廣泛用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析等領(lǐng)域中,其以組織為基礎(chǔ),適用于石蠟包埋的組織塊,通過檢測(cè)基因拷貝數(shù)來(lái)評(píng)估HER-2 基因水平,是HER-2基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)［7］。與IHC 技術(shù)相比,FISH 技術(shù)有如下優(yōu)勢(shì)：對(duì)低倍、高倍和染色體非整倍性的擴(kuò)增檢測(cè)均有較高的準(zhǔn)確率,靈敏度、特異度高,結(jié)果為雙色熒光信號(hào),能避免綠色熒光的干擾,直接準(zhǔn)確得到基因擴(kuò)增的拷貝數(shù),是目前HER-2 基因擴(kuò)增的金標(biāo)準(zhǔn)。

本次研究結(jié)果顯示：IHC 與FISH 檢測(cè)結(jié)果一致性較好(Kappa 值=0.543,P<0.05),而IHC 技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低等優(yōu)勢(shì),而FISH 技術(shù)檢測(cè)步驟繁瑣、要求高,故而IHC 可以作為了解乳腺癌患者HER-2 基因擴(kuò)增及表達(dá)的重要篩查方法,對(duì)于檢測(cè)結(jié)果為無(wú)表達(dá)或低表達(dá)(0/+)的患者,可以不做FISH 檢測(cè),而對(duì)于IHC 檢測(cè)結(jié)果為高表達(dá)(+++、++)的患者,則需進(jìn)一步做FISH 檢測(cè)確診。

17 號(hào)染色體多體的定義尚未形成共識(shí),但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為當(dāng)平均每個(gè)細(xì)胞中的17 號(hào)染色體≥3 個(gè)時(shí),即17 染色體多體［8］。17 號(hào)染色體僅經(jīng)雙探針原位雜交法才能反映,單探針法無(wú)法反映。本研究結(jié)果顯示：17 號(hào)染色體多體總發(fā)生率為18.00%,IHC 為高表達(dá)的17 號(hào)染色體多體發(fā)生率與低表達(dá)或無(wú)表達(dá)的17 號(hào)染色體多體發(fā)生率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。作者認(rèn)為,17 號(hào)染色體的多體可能是造成IHC 與FISH技術(shù)檢測(cè)結(jié)果不一致的原因之一,如果存在17 號(hào)染色體多體,即使是IHC 檢測(cè)為+++、++,經(jīng)FISH 技術(shù)檢測(cè)也可能出現(xiàn)無(wú)擴(kuò)增或低擴(kuò)增現(xiàn)象,引起假陰性結(jié)果,影響臨床診療。

綜上所述,乳腺癌HER-2 基因檢測(cè)中IHC 與FISH 技術(shù)檢測(cè)的結(jié)果一致性較好,但17 號(hào)染色體多體可能是導(dǎo)致兩種方法檢測(cè)結(jié)果不一致的原因之一,臨床醫(yī)師應(yīng)結(jié)合患者的實(shí)際情況選擇合適的基因檢測(cè)方法,FISH 技術(shù)可以作為HER-2 基因擴(kuò)增的確診手段應(yīng)用。