紫娟茶化學(xué)成分及其抗炎抗氧化活性研究

李明超，桂浩鑫，李曉蕾，劉 瑩，李宇倩，徐天瑞，郝 倩*

1昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 云南省高校靶點(diǎn)藥物篩選與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；2昆明理工大學(xué)分析測(cè)試中心，昆明 650093

“紫娟”為山茶科(Theaeeae)山茶屬(Camellia)茶組植物(Camelliasinensis(L.) O．Kuntze),是云南大葉茶變種，因其芽尖、葉、莖、花萼、花梗呈紫色，其茶湯呈淡紫色而得名[1]。紫娟有云南大葉群體國家級(jí)茶樹良種單株培育而成[2]，與常規(guī)大葉綠茶相比，其所含花青素、黃酮類、咖啡堿、鋅的含量較高[3]。研究發(fā)現(xiàn)紫娟茶具有抗氧化[4]、抗炎[5]、降壓[6]、降脂[7]、抗增殖[8]及抑菌[9]等功效，其化學(xué)成分主要含有花青素類、黃酮及其苷類和兒茶素類[2,3]。本文對(duì)紫娟甲醇提取物進(jìn)行分離純化，旨在豐富該植物的化學(xué)成分研究。此外，對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行了抗炎和抗氧化活性測(cè)定，為紫娟茶的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論參考。

1 儀器與材料

Avance III 600 MHz超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士Bruker BioSpin公司)，ODS(日本YMC維美希公司)，Sephadex LH-20(美國Pharmacia公司)，Diaion HP 20SS(日本三菱公司)，Toyopearl HW40F(日本東曹公司)，高效液相色譜儀(日本島津制作所)，80～100目和200～300目柱色譜硅膠(青島海洋化工廠)，硅膠GF254薄層預(yù)制板(青島海洋化工廠)，超純水儀(南京權(quán)坤生物科技有限公司)，超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，三用紫外分析儀(上海力辰儀器科技有限公司)，氘代試劑(美國劍橋CIL(同位素標(biāo)準(zhǔn)品)公司)，色譜純甲醇和乙腈(美國BCR公司)，其他試劑為分析純(西隴化工公司(四川))，一氧化氮測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)。

紫娟茶2017年購買于云南省西雙版納傣族自治州勐?？h，樣品由昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院郝倩博士鑒定，樣品標(biāo)本(ZJ-1701)存于昆明理工大學(xué)基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)中心403實(shí)驗(yàn)室。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取和分離

紫娟茶1.5 kg，用3倍量的70%的甲醇水(含1%的TFA)超聲提取4次，過濾，減壓濃縮后經(jīng)乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯相(AcOEt Fr.)182.4 g，水相(Aq Fr.)256.5 g。取乙酸乙酯部分(14.2 g)，經(jīng)過Diaion HP 20SS柱色譜甲醇水(0%→100%)梯度洗脫，得到6個(gè)組分Fr.1～Fr.6。Fr.2(0.21 g)采用Sephadex LH-20凝膠柱色譜乙醇-水-丙酮(1∶0∶0、9∶1∶0、8∶2∶0、6∶4∶0、0∶1∶1)洗脫，得到化合物1(10.7 mg)(圖1)。Fr.4(1.20 g)經(jīng)Diaion HP 20SS柱色譜甲醇-水(0%→100%)梯度洗脫，得到Fr.4-1～Fr.4-9。其中Fr.4-3(651.8 mg)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜乙醇-水-丙酮(1∶0∶0、9∶1∶0、8∶2∶0、6∶4∶0、0∶1∶1)洗脫，分離得到化合物2(3.1 mg)和化合物3(40.4 mg)，F(xiàn)r.4-5(66.4 mg)經(jīng)ODS柱色譜甲醇-水(20%→100%)得到化合物4(2.8 mg)和化合物5(2.1 mg)；Fr.4-9經(jīng)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇)純化得到化合物6(31.5 mg)。Fr.5(3.39 g)Toyopearl HW40F柱色譜甲醇-水(20%→100%)梯度洗脫，合并相同流分得到Fr.5-1～Fr.5-3，F(xiàn)r.5-1經(jīng) ODS柱色譜甲醇-水(20%→100%)洗脫得化合物7(9.7 mg)，F(xiàn)r.5-2分別經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜乙醇-水-丙酮(1∶0∶0、9∶1∶0、8∶2∶0、6∶4∶0、0∶1∶1)和ODS柱色譜甲醇-水(20%→100%)進(jìn)行洗脫，分離得到化合物化合物8(182.9 mg)。取水相部分(46.5 g)，經(jīng)Diaion HP 20SS柱色譜甲醇-水(0%→100%)梯度洗脫，得到9個(gè)組分Fr.w1～Fr.w9。Fr.w2(4.72 g)依次經(jīng)Toyopearl HW40F柱色譜甲醇-水(20%→100%)，ODS柱色譜甲醇-水(20%→100%)梯度洗脫得到化合物9(12.1 mg)。Fr.w5(1.87 g)經(jīng)Toyopearl HW40F柱色譜甲醇-水(20%→100%)，ODS柱色譜甲醇-水(20%→100%)梯度洗脫得到化合物10(10.8 mg)和化合物11(2.2 mg)。Fr.w7(2.31 g)經(jīng)Diaion HP 20SS柱色譜甲醇-水(20%→100%)得到化合物12(12.0 mg)。Fr.w9(10.79 g)經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜尿素-丙酮洗脫得到聚合物(Polymer Fr.)3.01 g。

2.2 活性測(cè)定

2.2.1 抗炎活性測(cè)定

將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7按照6×104/mL的濃度鋪于96孔板，37 °C、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基中，18 h后加入濃度0.8 μg/mL脂多糖(LPS)，反應(yīng)24 h后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去LPS，清洗兩遍，之后加藥處理。藥物配置方法如下：紫娟茶粗提物、乙酸乙酯相、水相和聚合物按照5或50 μg/L的濃度溶解于無血清培養(yǎng)基；化合物1～12按照5和50 μmol/L的濃度溶解于無血清培養(yǎng)基。處理24 h后，使用碧云天生物技術(shù)公司生產(chǎn)的一氧化氮檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：062119191005)，按步驟操作，使用酶標(biāo)儀在540 nm下進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算出樣品中的NO濃度。

2.2.2 抗氧化活性測(cè)定

將人肺泡上皮細(xì)胞A549按照6×104/mL的濃度鋪于96孔板，37 °C、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)于含有10%的血清的DMEM培養(yǎng)基中，18 h后加入濃度0.8 μg/mL過氧化氫(H2O2)，反應(yīng)24小時(shí)后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去H2O2，清洗兩遍，之后加藥處理。藥物配置方法如下：紫娟茶粗提物、乙酸乙酯相、水相和聚合物按照5或50 μg/L的濃度溶解于無血清培養(yǎng)基；化合物1～12按照5 μmol/L和50 μmol/L的濃度溶解于無血清培養(yǎng)基。

圖1 化合物1～12的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structures of compounds 1-12

加藥處理24 h后，1 000 rpm離心5 min，收集細(xì)胞沉淀。用活性氧特異性探針DCFH-DA(無血清培養(yǎng)基1∶1 000稀釋)重懸細(xì)胞，每5 min混勻1次，共染色20 min，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度(激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光波長525 nm)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1黃色粉末；分子式為：C15H10O6；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：8.08(2H，d，J= 8.7 Hz，H-2'，H-6')，6.90(2H，d，J= 8.8 Hz，H-3'，H-5')，6.38(1H，s， H-6)，6.18～6.15(1H，m，H-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致，故鑒定化合物1為山柰酚。

化合物2灰白色粉末；分子式為C15H14O6；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.87(1H，d，J= 1.8 Hz，H-2′)，6.70(1H，dd，J= 8.2，1.8 Hz，H-5′)，6.65(1H，d，J= 8.1 Hz，H-6′)，5.84(1H，d，J= 2.3 Hz，H-8)，5.81(1H，d，J= 2.3 Hz，H-6)，4.09～4.06(1H，m，H-2)，3.25(1H，s，H-3)，2.78～2.74(1H，m，H-4a)，2.63(1H，dd，J= 16.7，2.8 Hz，H-4b)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致，故鑒定化合物2為(+)-表兒茶素。

化合物3白色無定形粉末；分子式為C22H18O10；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.85(2H，s，H-2′′，6′′)，6.84(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，6.71(1H，dd，J= 8.3，1.9 Hz， H-5′)，6.60(1H，d，J= 8.2 Hz，H-6′)，5.87(2H，q，J= 2.3 Hz，H-6，8)，5.42(1H， m，J= 4.2，2.3 Hz，H-3)，4.91(1H，s，H-2)，2.89(1H，dd，J= 17.3，4.6 Hz，H-4a)，2.75(1H，dd，J= 17.4，2.1 Hz，H-4b)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致，故鑒定化合物3為(-)表兒茶素沒食子酸酯。

化合物4黃色粉末；分子式為C15H10O8；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.34(2H，s，H-2′，6′)，6.37(1H，d，J= 2.1 Hz，H-8)，6.17(1H，d，J= 2.1 Hz，H-6)；13C NMR(150MHz，CD3OD)δ：175.8(C-4)，164.1(C-7)，161.1(C-5)，156.7(C-9)，146.5(C-2)，145.3(C-3′，5′)，135.9(C-4′)，135.5(C-3)，107.0(C-2′，6′)，103.0(C-10)，121.6(C-1′)，97.7(C-5)，92.9(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致，故鑒定化合物4為楊梅素。

在DH6101伏安特性儀實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上，伏安法測(cè)二極管2AP10和1N4007伏安特性采用電流表內(nèi)接法和電流表外接法，電路示意如圖1所示。電源電壓在0～10 V內(nèi)調(diào)節(jié)。通過對(duì)這兩種方法電路圖分析，發(fā)現(xiàn)這兩種實(shí)驗(yàn)方法都會(huì)存在誤差，其主要來源于電表內(nèi)阻接入電路而引起。在電流表外接實(shí)驗(yàn)中，電壓表和電流的讀數(shù)分別是U和I時(shí)，由于電壓表內(nèi)阻會(huì)進(jìn)行分流，這樣實(shí)際通過二極管的電流I'是小于I，它們之間滿足下面的關(guān)系式[6]：

化合物5白色粉末；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.97(1H，d，J= 1.9 Hz， H-2″)，6.92(1H，d，J= 1.9 Hz，H-6″)，6.86(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，6.71(1H，dd，J= 8.3，1.9 Hz， H-6′)，6.61(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5′)，5.92～5.79(2H，m，H-6，8)，5.41(1H，dt，J= 4.3，2.6 Hz，H-2)，4.97(1H，s，H-3)，3.72(3H，s，-OCH3)， 2.91(1H，dd，J= 17.3，4.6 Hz，H-4a)，2.79(1H，dd，J= 17.4，2.5 Hz，H-4b)，13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：166.1(C=O)，155.8(C-9)，156.5(C-5，7)，147.6(C-3″，5″)，144.6(C-3，4′)，139.1(C-4″)，130.1(C-1′)，120.0(C-1″)，117.7(C-6′)，114.5(C-5′)，113.6(C-2′)，110.4(C-2″，6″)，97.89(C-10)，95.0(C-6)，94.3(C-8)，77.1(C-2)，68.9(C-3)，25.2(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致，故鑒定化合物5為表沒食子兒茶素-3-O-(3″-O-甲基)沒食子酸酯。

化合物6黃色粉末；分子式為C15H10O7；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.73(1H，d，J= 2.1 Hz，H-2′)，7.63(1H，dd，J= 8.5，2.1 Hz，H-6′)，6.88(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′)，6.39(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，6.18(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：175.9(C-4)，164.1(C-7)，161.1(C-5)，156.8(C-2)，147.3(C-9)，146.5(C-3′)，144.8(C-4′)，135.8(C-3)，122.7(C-3)，120.2(C-6′)，114.8(C-2′)，114.5(C-5′)，103.1(C-10)，97.8(C-6)，92.9(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致，故鑒定化合物6為槲皮素。

化合物7無色針狀結(jié)晶；分子式為 C7H6O5；1H NMR(600 MHz，Methanol-d4)δ：6.87(2H，s，H-2，6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致，故鑒定化合物7為沒食子酸。

化合物8白色粉末；分子式為C22H18O11；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.96(2H，s，H-2″，6″)，6.52(2H，s，H-2′，6′)，5.98(1H，s，H-6)，5.56～5.49(1H，m，H-3)，2.99(1H，dd，J= 17.2，4.6 Hz，H-4a)，2.86(1H，dd，J= 17.4，2.2 Hz，H-4b)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致，故鑒定化合物8為表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯。

化合物9白色粉末；分子式為C14H16O10；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.00(2H，s，H-2″，6″)，5.28(1H，q，J= 6.4 Hz，H-3)，4.16(1H，dt，J= 7.2，3.5 Hz， H-5)，2.28(2H，dd，J= 12.7，3.6 Hz，H-2)，2.15(1H，dd，J= 13.4，3.6 Hz，H-6a)， 1.97(1H，dd，J= 13.0，8.5 Hz，H-6b)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致，故鑒定化合物9為3-O-沒食子?；鼘帯?/p>

化合物10淺棕色粉末；分子式為C27H22O18；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.14(2H，s，H-2″，6″)，6.69(1H，s，HHDP-H)，6.55(1H，s，HHDP-H)，5.67(1H，d，J= 8.1 Hz，H-1)，5.23(1H，dd，J= 13.3，6.4 Hz，H-6)，4.88～4.82(1H，s，H-4)，4.08～4.02(1H，m，H-5)，3.82(1H，d，J= 12.7 Hz，H-3)，3.75～3.69(1H，m，H-6)，3.62(1H，d，J= 8.2 Hz，H-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道一致，故鑒定化合物10為小木麻黃素。

化合物11淡黃色粉末；分子式為C27H24O18；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.14(2H，s，H-2′′′，6′′′)，7.09(2H，s，H-2′′，6′′)，7.06(2H，s，H-2′，6′)，5.78(1H，d，J= 8.2 Hz，H-4)，5.22(1H，t，J= 9.7 Hz，H-4)，4.43(1H，dd，J= 12.4，2.1 Hz，H-6)，4.21(1H，dd，J= 12.4，4.8 Hz，H-1)，4.05(1H，ddd，J= 10.0，4.8，2.2 Hz，H-3)，3.83(1H，t，J= 9.3 Hz，H-5)；13CNMR(150 MHz，CD3OD)δ：166.6(C-7′)，166.0(C-7′′′)，165.5(C-7′)，145.1(C-5′)，145.1(C-5′′′)，145.0(C-5′′)，139.0(C-4′′)，138.6(C-4′)，138.4(C-4′′′)，119.7(C-1′′)，119.5(C-1′)，119.1(C-1′′′)，109.1(C-2′，6′)，108.9(C-2′′， 6′′)，108.8(C-2′′′，6′′′)，94.4(C-1)，74.6(C-5)，73.0(C-3)，72.8(C-2)，70.4(C-4)，62.1(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道一致，故鑒定化合物11為1，4，6-三-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖。

化合物12白色粉末；分子式為C8H10N4O2；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.76(1H，s)，3.90(3H，s)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道一致，故鑒定化合物12為咖啡因。

3.2 活性測(cè)定結(jié)果

3.2.1 抗炎活性測(cè)定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用脂多糖(LPS) 誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞生成的NO 細(xì)胞模型對(duì)紫娟茶粗提物、乙酸乙酯相、水相和聚合物進(jìn)行了抗炎活性測(cè)定，以LPS為陽性對(duì)照，測(cè)試濃度為5和50 μg/L；同時(shí)，對(duì)化合物1～12進(jìn)行了抗炎活性測(cè)定，以LPS為陽性對(duì)照，測(cè)試濃度為5和50 μmol/L，通過測(cè)定粗體物或化合物抑制NO的生成來評(píng)價(jià)其抗炎活性。

結(jié)果(見圖2)顯示，5或50 μg/L濃度下粗提物、乙酸乙酯相，50 μg/L的聚合物均有一定的抗炎活性。在5和50 μmol/L的濃度下，化合物1、3、4、6、8～11均對(duì)NO抑制率顯著，表明其具有顯著的抗炎活性。

圖2 紫娟茶提取物和化合物1～12抗炎活性測(cè)定Fig.2 Anti-inflammatory activity of Zijuan tea extract and compounds 1-12

3.2.2 抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

結(jié)果見圖3，5 μg/L的粗提物、乙酸乙酯相，50 μg/L乙酸乙酯相、聚合物均具有顯著的抗ROS活性，表明其具有明顯的抗氧化活性?；衔?～3、11～12抗ROS活性均顯著，表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性。其中化合物11的抗氧化活性最明顯。

圖3 紫娟茶提取物和化合物1～12抗氧化活性測(cè)定Fig.3 Determination of antioxidative activity of Zijuan tea extract and compounds 1-12

4 結(jié)論

目前，對(duì)紫娟茶中的功能性成分研究較少，因此本文對(duì)紫娟茶的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究。從中共分離鑒定了12個(gè)化合物以及大量聚合物，其中3個(gè)黃酮類化合物(1、4、6)、4個(gè)兒茶素類化合物(2、3、5、8)，2個(gè)單寧類化合物(10和11)，1個(gè)奎寧類化合物(9)，1個(gè)沒食子酸(7)以及1個(gè)咖啡因(12)。通過抗炎、抗氧化活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)化合物11表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，化合物1、3、4、6、8～11均具有顯著的抗炎活性。此外，從紫娟茶水相分離得到的聚合物中含有抗炎、抗氧化活性成分，今后可深入研究其組成及藥理活性。本文為紫娟茶的綜合開發(fā)和利用提供了一定理論基礎(chǔ)和依據(jù)。