同步降解黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的復合益生菌研制

王 濤， 李慧娟， 耿啟泉， 常 娟， 王 平， 尹清強*，劉超齊， 朱 群

（1.河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南鄭州 450046；2.河南省鄭州種畜場，河南鄭州 450011；3.河南省衛(wèi)輝市農業(yè)農村局，河南衛(wèi)輝 453100；4.河南德鄰生物制品有限公司，河南新鄉(xiāng) 453000）

黃曲霉毒素主要是由真菌屬的黃曲霉菌或寄生曲霉菌產(chǎn)生的一類帶香豆素和雙呋喃環(huán)的毒性代謝產(chǎn)物。在飼料中，黃曲霉毒素多數(shù)來自于發(fā)霉的玉米（段保寧，2018）。在黃曲霉毒素中，AFB1被世界癌癥研究中心列為人類第一類致癌物，被認定是最強并最常見的致癌物質（Marroquíncardona等，2014），其毒性是氰化鉀的10倍、砒霜的68倍、亞硝胺的75倍（Choudhury等，2011）。 人類在誤食了含有黃曲霉毒素的食物后，可導致黃曲霉毒素急性中毒 （朱輝，2012），同時肝臟也受到損害，甚至誘發(fā)肝癌（Gholami-Ahangaran 等，2016）。

玉米赤霉烯酮又稱F-2毒素，是由禾谷鐮刀菌 （Fusarium graminearum）、木賊鐮孢（Fusarium equiseti）、三線鐮刀菌（Fusarium tricinctum）等真菌在適宜的條件下，生成的一類非甾體結構的化合物，具有類雌激素活性（Kuiper等，1997）。ZEA污染糧食后，在加工過程中不易被消除，進入飼料、動物養(yǎng)殖甚至食品加工領域，引起嚴重的食品安全問題，甚至危害人類的健康（陳繼發(fā)等，2016；王怡凈等，2002）。

近些年，霉菌毒素問題已經(jīng)困擾了大多數(shù)畜牧產(chǎn)業(yè)，造成了巨大經(jīng)濟損失。由于目前關于單一AFB1或ZEA的吸收、代謝和危害的研究較多，而同時對兩種毒素的交互作用、疊加毒性及危害機理的研究較少，有必要做深入研究。霉菌毒素的脫毒方式分為物理法、化學法以及生物法，其中霉菌毒素生物降解法被公認為是最有效的方法。本研究選用具有降解霉菌毒素能力的枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌與產(chǎn)朊假絲酵母，利用響應面回歸設計獲得最佳的復合益生菌配伍對兩種霉菌毒素進行降解，為消除霉菌毒素的危害奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、酵母浸粉5 g/L，用蒸餾水定容至1 L，用NaOH溶液調節(jié)使pH為7.0，在121℃、1.034×105Pa條件下高壓蒸汽滅菌20 min，于4℃保存?zhèn)溆?。YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L，用蒸餾水定容至1 L，在121℃、1.034×105Pa條件下高壓蒸汽滅菌20 min，4℃保存?zhèn)溆谩RS培養(yǎng)基（g/L)：胰蛋白胨15 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、乙酸鈉2 g/L、檸檬酸二銨2 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.05 g/L、吐溫80 1 mL，用蒸餾水定容至1 L，在121℃、1.034×105Pa條件下高壓蒸汽滅菌20 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌種的活化與培養(yǎng) 枯草芽孢桿菌接種到LB培養(yǎng)基上，37℃、200 r/min培養(yǎng)；干酪乳桿菌接種到MRS培養(yǎng)基上，37℃靜止狀態(tài)下培養(yǎng)；產(chǎn)朊假絲酵母接種到YPD培養(yǎng)基上，30℃、200 r/min培養(yǎng)。三種菌培養(yǎng)24 h后分別按2%的接種量接入對應的新鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h后測定活菌數(shù)。

1.3 復合益生菌體外降解霉菌毒素的響應面回歸設計 基于生產(chǎn)實際考慮，將上述的益生菌活菌數(shù)調至 1.0×105、1.0×106、1.0×107cfu/mL，運用響應面回歸法進行三因素三水平試驗設計，測定降解霉菌毒素效果最佳的組合。利用Design-Expert 8.0.6軟件，采用Box-Behnken Design （BBD）設計、模型擬合和數(shù)據(jù)分析。試驗因素及水平見表1。

表1 試驗設計因素及編碼水平cfu/mL

為了體現(xiàn)自變量和因變量的關系，采用二次多項方程進行擬合，預測二次多項方程式如下：Y=β0+β1X1+β2X2+β3X3+β11X12+β22X22+β33X32+β12X1X2+β13X1X3+β23X2X3。式中：Y 是益生菌組合對霉菌毒素的降解率；X1、X2、X3是自變量，分別對應枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母；β0是截距；β1、β2、β3是線性系數(shù)；β11、β22、β33是平方系數(shù)；β12、β13、β23是交叉系數(shù)。

1.4 復合益生菌體外同步降解AFB1+ZEA的測定方法 對照組：1.825 mL生理鹽水+3 mL MRS培養(yǎng)基+0.125 mL AFB1標準品（2 mg/L）+0.05 mL ZEA標準品（50 mg/L）。試驗組：不同體積的三種益生菌，加入 0.125 mL AFB1標準品（2 mg/L）和0.05 mL ZEA 標準品（50 mg/L），加入 3 mL MRS培養(yǎng)基，再加生理鹽水補足5 mL。該設計共18個試驗組，每個試驗組做3個重復，每個重復設定AFB150μg/L、ZEA 500μg/L。 在37℃及200 r/min恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h，然后在4℃及10000 r/min的離心機中離心5 min，取一定量的上清液，利用拜發(fā)試劑盒測定ZEA和AFB1的含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步整理后，采用Design-Expert 8.0.6軟件對響應面數(shù)據(jù)進行分析。采用SPSS 17統(tǒng)計分析軟件對各組數(shù)據(jù)進行方差分析和Duncan多重比較，差異顯著性用P＜0.05表示，所有結果均以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken試驗設計，其中對照組24 h后ZEA含量為589.60μg/L，AFB1含量為57.75μg/L， 對試驗組AFB1+ZEA的降解率進行回歸分析，建立響應面二次回歸模型，尋求最優(yōu)因素水平，試驗結果與回歸方程方差分析見表2～4。利用Design-Expert 8.0.6對數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，由于在模型上選擇“Quadratic”2次方重復多次試驗所得的R2結果均偏低，于是選用模型“Cubic”三次方得出回歸模型方程如下：

在選擇模型“Cubic”三次方的基礎上，多項及三次方的系數(shù)為0，所以方程里未出現(xiàn)系數(shù)為0的多項。與上述分析相似，由表3和表4可知，兩個響應值的模型P＜0.05，說明此模型可用，在統(tǒng)計學上有意義?；貧w模型的決定系數(shù)為R2和 R2adj均大于0.80，說明回歸方程的擬合度越好。基于響應面分析，當枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌與產(chǎn)朊假絲酵母的活菌數(shù)分別為 1×107、1×106、1×107cfu/mL時，同時降解兩種毒素的效果最好，實測AFB1降解率為38.67%，ZEA降解率為26.29%。

表2 Box-Behnken設計參數(shù)與AFB1和ZEA降解率%

表3 AFB1降解率響應面回歸方程系數(shù)的方差分析

3 討論

當兩種以上的霉菌毒素同時存在時，其毒性常常有加性效應（曹冬梅等，2010）。研究表明，多種霉菌毒素聯(lián)合可引起動物慢性中毒，甚至導致癌癥發(fā)生及免疫抑制 （Battacone等，2003；Avantaggiato等，2003）。據(jù)報道，ZEA 與 AFB1存在一定的劑量依賴關系，在AFB1濃度低的條件下，ZEA可以降低AFB1的腎細胞毒性，但當AFB1濃度高的時候，ZEA則與其呈現(xiàn)出協(xié)同毒性效應（雷明彥，2013）。 Williams 等（1994）報道，生長豬食用被ZEA和DON污染的玉米后，其生長性能受到影響，日采食量和日增重均下降。范彩云等（2017）研究表明，單一AFB1以及其與ZEA聯(lián)合均能影響奶山羊腸道微生物區(qū)系的結構，其中混合毒素作用比單一毒素影響更大，此外混合毒素聯(lián)合作用后，山羊的腸道微生物總數(shù)顯著降低。本研究得到的復合益生菌組合可同時降解AFB1和ZEA，但與單一的毒素降解效果對比，兩種毒素同時降解的效率都偏低，推測在添加益生菌菌液后，兩種毒素存在協(xié)同作用，從而對益生菌的降解產(chǎn)生抵制。

表4 ZEA降解率響應面回歸方程系數(shù)的方差分析

4 結論

本試驗結果表明，枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、 產(chǎn)朊假絲酵母活菌數(shù)分別為 1×107、1×106、1×107cfu/mL時，可顯著地降解AFB1和ZEA，AFB1和ZEA的降解率分別為38.67%、26.29%。