參與腎小球壁層上皮細(xì)胞活化和表型轉(zhuǎn)化的信號(hào)通路

趙雪茹 黃巖杰, 楊曉青 綜述 張建江 劉翠華 丁 櫻, 審校

生理狀態(tài)下,腎小球壁層上皮細(xì)胞(PEC)呈扁平狀排列在包囊的內(nèi)表面[1-3]。在腎小球尿極，PEC與近端腎小管上皮細(xì)胞延續(xù)；而在血管極，PEC與腎小球足細(xì)胞延續(xù)，可表達(dá)足細(xì)胞分子表型[1,3-5]。PEC在多種腎小球疾病中表現(xiàn)活躍，尤其是在新月體性腎小球腎炎(CrGN)[6]和塌陷型局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS)[2]。在這些疾病中PEC 的病理反應(yīng)多繼發(fā)于腎小球毛細(xì)血管基膜[6]、內(nèi)皮細(xì)胞及足細(xì)胞的損傷，涉及復(fù)雜的信號(hào)通路。與其他腎小球固有細(xì)胞相比，PEC具有祖細(xì)胞特性，在腎臟損傷和修復(fù)中的病理機(jī)制獨(dú)特而重要。本文重點(diǎn)綜述在CrGN和FSGS病變中參與PEC的活化、增生、遷移和表型轉(zhuǎn)化的信號(hào)傳導(dǎo)通路，旨在為以PEC病變?yōu)橹鞯哪I臟疾病尋求新的治療靶點(diǎn)。

PEC活化和增殖的信號(hào)通路

活化的特異性標(biāo)志物活化的PEC呈立方形，細(xì)胞核增大[2]，偶爾有胞質(zhì)空泡及蛋白滴形成，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖、遷移或細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生增加等，進(jìn)而引起腎小球增生性疾病，如CrGN、FSGS等。超微結(jié)構(gòu)研究表明腎小球新月體主要由PEC組成[2,7]。近年的研究顯示CD44、 ERK-1/2是PEC活化的特異性標(biāo)志物[8-10]。CD44是一種細(xì)胞表面糖蛋白，在細(xì)胞分化、遷移、細(xì)胞-基質(zhì)結(jié)合、白細(xì)胞運(yùn)輸和疤痕形成等過程中起關(guān)鍵作用[4,8,11]。2017年Miesen等[12]通過免疫染色實(shí)驗(yàn)證明CD44是PEC活化的特異性標(biāo)志物。在FSGS小鼠模型中,用強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)β半乳糖苷酶(β-gal)在PEC中永久性表達(dá)，包囊內(nèi)的PEC遷移到腎小球簇的數(shù)量增加，且CD44+PEC的數(shù)量也顯著增加[13]。在FSGS大鼠模型也發(fā)現(xiàn)活化的PEC CD44染色陽性[4]，大量產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)。在CD44基因敲除小鼠(CD44-/-)和野生型(WT)小鼠的新月體病變中[8]，發(fā)現(xiàn)CD44-/-小鼠腎小球細(xì)胞增殖與蛋白尿明顯減少，而WT小鼠新月體病變中CD44+的細(xì)胞數(shù)量增多，并在早期和進(jìn)展期增殖性病變的包囊中檢測到PEC均為CD44+。在體外實(shí)驗(yàn)中，與野生型比較，CD44基因敲低的小鼠PEC增生程度減弱，CD44抗體可抑制人PEC的遷移。以上實(shí)驗(yàn)表明CD44是PEC的特異性標(biāo)志物[14-15]。

ERK-1/2是一種細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，與細(xì)胞的增殖與分化密切相關(guān)，也是PEC活化的主要表面標(biāo)志物。在正常腎小球中，p-ERK-1/2表達(dá)陰性，但在CrGN及FSGS活化的PEC高表達(dá)p-ERK-1/2[14]。Roeder 等[14]分別使用p-ERK的抑制劑UO126和激動(dòng)劑MEK-DD處理體外培養(yǎng)PEC，發(fā)現(xiàn)UO126通過抑制ERK-1/2，減少CD44表達(dá)；相反，MEK-DD可通過激活ERK-1/2，誘導(dǎo)CD44表達(dá)從而導(dǎo)致PEC的激活和增殖。2019年Zhao等[11]通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了白蛋白通過激活ERK-1/2途徑誘導(dǎo)腎小球PEC中CD44表達(dá)。由此可知，CD44、ERK-1/2是PEC活化的特異性標(biāo)志物。

mTORC1/LAT2信號(hào)通路哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mTORC1)途徑激活在控制細(xì)胞生長和增殖的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中具有調(diào)節(jié)作用，支鏈氨基酸是強(qiáng)力的mTORC1刺激因子。研究發(fā)現(xiàn)[16]，在正常腎小球PEC和足細(xì)胞中，L型中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(LAT2)可能不參與正常氨基酸穩(wěn)態(tài),但在新月體形成時(shí)，在細(xì)胞因子和生長因子的刺激下，PEC胞漿中的LAT2及其配體4F2抗原重鏈(4F2hc)表達(dá)上調(diào)，在PEC胞膜形成LAT2-4F2hc復(fù)合物，促進(jìn)支鏈氨基酸進(jìn)入細(xì)胞，刺激mTORC1下游的效應(yīng)因子p70S6K，4E-BP1和S6-RP的磷酸化，激活mTORC1信號(hào)通路，引起PEC的活化、增殖和新月體的形成(圖1)。在大鼠CrGN模型，使用mTORC1抑制劑依維莫司(Everolimus)可導(dǎo)致PEC的壞死、防止細(xì)胞增殖[16]。因此，通過調(diào)控mTORC1/LAT2信號(hào)通路，抑制PEC的活化和增殖，將可能作為CrGN治療的一種新思路。

圖1 mTORC1通路的激活參與新月體腎炎發(fā)病的機(jī)制[16]mTORC1：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1；LAT2：L型中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2；4F2hc：4F2抗原重鏈；PEC：壁層上皮細(xì)胞?；罨膍TORC1上調(diào)LAT2及其配體4F2hc，LAT2-4F2hc復(fù)合物重新定位到細(xì)胞膜并增加氨基酸的流入，導(dǎo)致PEC的活化、增殖，用mTORC1抑制劑依維莫司治療可以減緩PEC病變的進(jìn)展

SSeCKS與cyclinD1解離Src抑制蛋白激酶C底物(SSeCKS)是A激酶錨定蛋白(AKAPs)家族中的一種細(xì)胞質(zhì)多價(jià)支架蛋白，含有蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點(diǎn)[17]。在正常腎小球中，PEC和腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)SSeCKS，可控制細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)的定位和活性、影響腎小球的增殖性損傷。SSeCKS可與細(xì)胞質(zhì)中的cyclinD1結(jié)合，使其滅活；SSeCKS被活化的PKC磷酸化后，其支架功能減弱，從而使SSeCKS與cyclinD1解離，導(dǎo)致cyclinD1從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，與細(xì)胞周期蛋白D依賴性激酶4(CDK4)形成活性復(fù)合物易位至細(xì)胞核，導(dǎo)致Rb腫瘤抑制蛋白(pRb)的過度磷酸化和S期誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(如轉(zhuǎn)錄因子E2F)的釋放，最終導(dǎo)致G 1期向S期進(jìn)展[18]，引起細(xì)胞增殖。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)cyclinD1的表達(dá)依賴于持續(xù)的ERK2激活，SSeCKS可通過下調(diào)ERK2激活來抑制cyclinD1轉(zhuǎn)錄。在敲除SSeCKS小鼠實(shí)驗(yàn)中[17]，SSeCKS的支架功能喪失，核cyclin D1表達(dá)增加且引起PEC增殖。因此防止SSeCKS與cyclinD1解離，可有效地糾正異常的PEC的活化。

PEC與足細(xì)胞的對(duì)話

Notch通路多年前已有研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路參與調(diào)控腎臟PEC的活化、增殖、表型轉(zhuǎn)化和遷移[19]。2018年Massa等[20]提出在生理?xiàng)l件下，足細(xì)胞不斷地將趨化因子CXCL12釋放到包囊中，PEC表達(dá)其受體即趨化因子受體4( CXCR4)，兩者結(jié)合可抑制PEC內(nèi)的Notch信號(hào)傳導(dǎo)。在病理?xiàng)l件下，足細(xì)胞的損傷導(dǎo)致CXCL12水平降低，對(duì)Notch通路的抑制作用減弱，導(dǎo)致PEC的活化、增殖[20]。體外研究顯示[19]，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)與PEC共培養(yǎng)，可觀察到PEC中活化的Notch信號(hào)分子1(Notch1)、Notch配體(Jagged1)和Notch靶基因(Hes1)表達(dá)明顯升高，并通過Boyde室遷移實(shí)驗(yàn)證明了TGF-β1通過Notch信號(hào)介導(dǎo)PEC的遷移，但不影響PEC的增生。TGF-β1也可誘導(dǎo)Notch依賴性的PEC向間充質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。在塌陷型FSGS小鼠模型，足細(xì)胞的丟失誘導(dǎo)了PEC增生、Notch信號(hào)通路激活、蛋白尿和腎損傷。抑制Notch通路，雖然減輕了PEC的增生性損傷，卻可能因?yàn)橥瑫r(shí)抑制了PEC的遷移和表型轉(zhuǎn)化而加重了塌陷型FSGS小鼠蛋白尿及腎組織病變。由于Notch通路功能復(fù)雜，如何靶向調(diào)控Notch信號(hào)防治FSGS還需要更多的研究。

AngII/SDF-1/CXCR4/ERK1/2通路在CrGN中，腎小球損傷可導(dǎo)致腎小球毛細(xì)血管基膜的通透性增加甚至斷裂[6]，浸潤的炎性細(xì)胞及其釋放的可溶性細(xì)胞因子和趨化因子進(jìn)入包囊腔，觸發(fā)PEC表達(dá)黏附分子和趨化因子受體(如CXCR4)[4]。同時(shí)，單核/巨噬細(xì)胞誘發(fā)局部血管緊張素II(AngII)產(chǎn)生增加；AngII可通過血管緊張素II的1型受體(AT1R)激活足細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子基質(zhì)衍生因子1(SDF-1)。SDF-1與其受體CXCR4的結(jié)合參與了CrGN中PEC的激活[1,4]。Kawaguchi等[21]研究顯示，在炎癥狀態(tài)下，與 SDF-1的結(jié)合導(dǎo)致CXCR4趨化構(gòu)象發(fā)生改變，誘發(fā)Src酪氨酸激酶家族激活Ras-Raf-促分裂原激活的蛋白激酶和ERK途徑，ERK1/2與CD44在PEC細(xì)胞膜上共定位，導(dǎo)致CD44高表達(dá)[14]，誘導(dǎo)PEC活化、增生[22]。

AngⅡ除通過SDF-1與CXCR4結(jié)合參與PEC活化，還直接影響PEC的活化與增殖。在大鼠進(jìn)行性腎小球損傷模型中[23]，AngⅡ可通過阻斷作為細(xì)胞周期抑制劑的轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白δ(C/EBPδ)，觸發(fā)PEC的有絲分裂，使PEC激活且增殖；ACE抑制劑(ACEI)可上調(diào)C/EBPδ的活性，抑制PEC增殖。這些發(fā)現(xiàn)也表明PEC是ACEI和AT1受體阻滯劑(ARB)治療的新型細(xì)胞靶標(biāo)。

HB-EGF/EGFR通路肝素結(jié)合表皮生長因子(HB-EGF)是一種細(xì)胞增殖與遷移的誘導(dǎo)劑[24-25]，生理狀態(tài)下在腎臟PEC和足細(xì)胞中僅低水平表達(dá)[26]。表皮生長因子受體(EGFR)是受體酪氨酸激酶ErbB家族中的一員[25]，可表達(dá)于腎小球PEC和足細(xì)胞，生理狀態(tài)下處于失活狀態(tài)。在CrGN小鼠模型中，足細(xì)胞和PEC中HB-EGF表達(dá)明顯上調(diào)，并誘導(dǎo)EGFR持續(xù)磷酸化[24]。在腎毒血清(NTS)小鼠模型中,腎小球PEC高表達(dá)HB-EGF前體，在金屬蛋白酶作用下HB-EGF前體被裂解釋放出可溶性片段激活EGFR[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)，解聚素金屬蛋白酶(ADAM)可以裂解PEC表達(dá)的HB-EGF前體，激活足細(xì)胞上的EGFR，并啟動(dòng)細(xì)胞增殖。PEC通過HB-EGF/EGFR信號(hào)通路對(duì)足細(xì)胞增生起促進(jìn)作用，參與了新月體形成(圖2)[26]。

圖2 HB-EGF激活EGFR參與新月體腎炎發(fā)病的機(jī)制[26]ADAM：解聚素金屬蛋白酶；HB-EGF：肝素結(jié)合表皮生長因子；EGFR：表皮生長因子受體；GBM：腎小球基膜；PEC：壁層上皮細(xì)胞；ADAM裂解PEC表達(dá)的HB-EGF前體，形成具有活性的HB-EGF片段，激活足細(xì)胞膜上表達(dá)的EGFR并促進(jìn)細(xì)胞增殖，最終形成新月體

EGFR下游的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)包括Ras-Raf-促分裂原激活的蛋白激酶、磷酸肌醇3激酶(PI3K)-AKT，誘導(dǎo)持續(xù)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致足細(xì)胞骨架重排、極性消失、nephrin脫落、足突融合、腎小球通透選擇性消失和后續(xù)的增生和遷移[25]。足細(xì)胞同時(shí)黏附在腎小球基膜(GBM)和壁層基膜(PBM)，在腎小球簇和包囊之間形成“橋梁”，且插入PEC之間，但不與這些細(xì)胞形成連接，促進(jìn)PEC增殖進(jìn)而形成新月體[27]。

HB-EGF等位基因的缺失或四環(huán)素誘導(dǎo)消除足細(xì)胞中EGFR基因均能顯著減緩CrGN進(jìn)展、改善腎功能[25]。EGFR磷酸化抑制劑AG1478可顯著抑制新月體形成。敲除足細(xì)胞EGFR基因，可部分但顯著抑制腎小球損害和新月體形成，提示足細(xì)胞可以通過旁分泌HB-EGF，與PEC表達(dá)的EGFR相互作用。另一方面，PEC也可自分泌HB-EGF，并作用于自身表達(dá)的EGFR引起新月體病變[24-25]。因此，PEC與足細(xì)胞通過HB-EGF/EGFR信號(hào)通路的對(duì)話，有望成為新月體腎炎防治的靶標(biāo)。

PDGF/PDGFR通路血小板衍生生長因子(PDGF)是由硫化物鍵合的二聚體結(jié)構(gòu)組成的生長調(diào)節(jié)分子家族[28]。免疫組化染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)在正常人腎臟的足細(xì)胞中表達(dá)血小板源性生長因子D(PDGF-D)[29]。過度表達(dá)PDGF-D可誘導(dǎo)CrGN和腎小球硬化[1]。PDGF-D可與PDGF-β受體結(jié)合，PDGF-β受體定位于腎小球系膜細(xì)胞、PEC和間質(zhì)成纖維細(xì)胞中，由此可以推測PEC的增殖可能由足細(xì)胞來源的PDGF-D激活PDGFR所引起，并且通過這些細(xì)胞之間潛在的旁分泌相互作用導(dǎo)致細(xì)胞的活化與增殖[28]。

PEC向足細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化

Wnt/β-Catenin通路Wnt蛋白信號(hào)觸發(fā)β-Catenin的穩(wěn)定性及其核易位和活性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的形成，使T細(xì)胞因子(TCF)/Lef轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，導(dǎo)致Wnt蛋白基因下游C-myc、CyclinD1表達(dá)增加，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、血管生成、炎癥和纖維化[1]，且參與腎單位發(fā)育[30]。Wnt/β-Catenin是一種“規(guī)范”的在進(jìn)化上保守和多功能的信號(hào)通路(依賴β-Catenin)[31]，研究發(fā)現(xiàn)[30]，PEC的命運(yùn)依賴于Wnt/β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)，在Wnt/β-Catenin信號(hào)指導(dǎo)下PEC可正確分化；而在缺乏Wnt/β-Catenin信號(hào)時(shí)，用Pax8Cre誘導(dǎo)的β-Catenin基因敲除小鼠中， WT1高表達(dá)，引起上皮細(xì)胞高表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，促使S形小球階段的細(xì)胞逐漸成熟，誘導(dǎo)PEC向足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，電鏡下可見S形小球壁細(xì)胞層中正在發(fā)育的足細(xì)胞，而在成熟的腎小球中，足細(xì)胞形成足突并吸附毛細(xì)血管。此外，WT1可下調(diào)啟動(dòng)子Pax-23，抑制Wnt/β-Catenin通路，促進(jìn)PEC向足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化[7]。因此減弱Wnt/β-Catenin信號(hào)通路，可促進(jìn)PEC向足細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。

miR-193a miR-193a具有調(diào)控PEC與足細(xì)胞分化的“分子開關(guān)”作用[7,13]。在腎毒血清小鼠模型中,抑制PEC的miR-193a表達(dá)，可使其轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨确只淖慵?xì)胞表型，從而阻止其增殖、遷移和新月體形成[7]。經(jīng)慢病毒介導(dǎo)敲除miR-193a則可使培養(yǎng)的人PEC獲得足細(xì)胞表型。用miR-193a 處理人PEC導(dǎo)致其形態(tài)向足細(xì)胞典型的樹狀表型轉(zhuǎn)變[7]。WT-1是miR-193a的主要靶基因，miR-193a過表達(dá)可顯著降低WT-1表達(dá)，并引起WT-1依賴性基因Podxl和Nphs1的低表達(dá)[32]，使足細(xì)胞的形態(tài)及穩(wěn)定性發(fā)生改變，引起PEC特異性表面標(biāo)志物(如CD44)的過表達(dá)和疾病發(fā)生。小鼠經(jīng)多西環(huán)素誘導(dǎo)的miR-193a過表達(dá)導(dǎo)致WT-1抑制、WT-1依賴性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(如Podxl，Nphs1和Sulf1)的丟失、以及足細(xì)胞去分化[7]。因此抑制miR-193a上調(diào)，可顯著增強(qiáng)PEC向足細(xì)胞分化及WT-1表達(dá)，阻止疾病進(jìn)展、促進(jìn)病變恢復(fù)。靶向控制miR-193a表達(dá)有望為CrGN及FSGS的治療提供新思路。

小結(jié):多種通路與PEC的活化、增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)化等有關(guān)，參與了CrGN及FSGS的發(fā)生發(fā)展。病理狀態(tài)下，PEC和足細(xì)胞還可通過配體與受體的交叉對(duì)話，導(dǎo)致PEC的活化、增殖和遷移。下調(diào)Wnt/β-Catenin信號(hào)通路和抑制miR-193a，均可促使PEC獲得足細(xì)胞表型，從而阻止PEC增殖和遷移，改善CrGN和FSGS。靶向調(diào)控上述信號(hào)通路，有望為以PEC病變?yōu)橹鞯哪I臟疾病尋求新的治療方案。