血小板反應(yīng)蛋白1在局灶節(jié)段性腎小球硬化伴急性腎小管間質(zhì)損傷的表達(dá)

袁 蓓 夏園園 呂亞男 張明超 趙 越 陳朝紅 曾彩虹

局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)屬于足細(xì)胞病,臨床主要表現(xiàn)為腎病綜合征，許多患者初始對激素治療敏感，復(fù)發(fā)后激素再治療常不敏感，或者初始就對激素治療不敏感，最終進(jìn)展為終末期腎病(ESRD)[1-3]。FSGS的損傷不僅在足細(xì)胞，常伴不同程度腎小管間質(zhì)的急性損傷[4]。東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院國家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心前期研究顯示FSGS患者急性腎損傷(AKI)的發(fā)生率達(dá)44.4%[2]，而組織學(xué)不同程度的急性腎小管間質(zhì)損傷達(dá)88%[1]。因此FSGS急性腎小管間質(zhì)損傷是不容忽視的問題，而且影響患者對激素治療的敏感性[5]。雖然FSGS腎小管間質(zhì)損傷機(jī)制已有大量相關(guān)研究，但其發(fā)生機(jī)制尚不清楚。血小板反應(yīng)蛋白1(TSP-1)是一種細(xì)胞外基質(zhì)聚糖蛋白，與不同配體或受體結(jié)合，在細(xì)胞的黏附、遷移、增殖、損傷修復(fù)、炎癥、血管形成過程中發(fā)揮重要作用[6]。在腎臟缺血再灌注損傷(IRI)所造成的AKI動物模型中發(fā)現(xiàn)腎小管TSP-1表達(dá)迅速增加[7]。因此本研究旨在探討FSGS伴急性腎小管間質(zhì)損傷時，腎組織TSP-1及其受體信號調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)的表達(dá)情況，并分析TSP-1表達(dá)與臨床病理的相關(guān)性。

對象和方法

研究對象納入2015年3月至2017年3月在國家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心住院經(jīng)腎活檢確診的FSGS，同時伴急性腎小管間質(zhì)損傷的患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)尿蛋白定量>3.5 g/24h，血白蛋白<30 g/L；(2)特發(fā)性FSGS伴有急性腎小管間質(zhì)損傷。排除標(biāo)準(zhǔn)如下:(1)合并藥物或感染相關(guān)小管間質(zhì)性腎炎；(2)繼發(fā)性FSGS,如高血壓腎損害、肥胖相關(guān)腎損害、有機(jī)溶劑腎損害等；(3)中毒、創(chuàng)傷、感染、手術(shù)相關(guān)急性腎臟損傷；(4)其他:ESRD、常染色體顯性遺傳性多囊腎、腎移植、腫瘤、肝硬化、活動性感染等。并收集15例腎癌切除術(shù)患者的癌旁正常腎組織作為正常對照。

臨床資料收集患者病程、性別、年齡等一般資料，腎活檢時實驗室檢查指標(biāo)，包括24h尿蛋白定量、血清白蛋白(Alb)、球蛋白(Glb)、血清肌酐(SCr)，尿視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)和尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)等。

腎臟病理所有病例均在B超引導(dǎo)下行經(jīng)皮腎穿刺活檢術(shù)，常規(guī)行光鏡、免疫熒光及電鏡染色。急性腎小管間質(zhì)損傷的病理定義：腎組織皮質(zhì)區(qū)非萎縮區(qū)域的腎小管急性損傷(近端小管上皮細(xì)胞細(xì)胞刷狀緣脫落、甚至壞死)，間質(zhì)明顯的炎細(xì)胞浸潤，伴或不伴小管炎和(或)間質(zhì)水腫。急性腎小管間質(zhì)損傷程度根據(jù)腎小管間質(zhì)病變累及范圍分級：<25%為輕度；25%～50%為中度；>50%為重度。

免疫組化檢測取腎組織石蠟切片，脫蠟入水，利用高壓鍋進(jìn)行抗原修復(fù)，分別加入一抗TSP-1抗體(Santa Cruz)、SIRPα抗體(Abcam)，室溫孵育2h，PBS洗5 min，加入二抗室溫孵育30 min，PBS洗5 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染2 min，中性樹膠封片。利用徠卡Aperio數(shù)字病理系統(tǒng)(ScanScope AT Turbo)進(jìn)行全切片掃描，手工圈出蛋白染色陽性區(qū)域和腎小管間質(zhì)總區(qū)域，通過Aperio相關(guān)配套軟件計算出相應(yīng)面積，并計算蛋白分子表達(dá)陽性率=(蛋白分子陽性表達(dá)面積/腎小管間質(zhì)總面積)×100%。

統(tǒng)計學(xué)方法采用《SPSS19.0》軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。以單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗。所有計量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)(四分位間距)表示，組間比較應(yīng)用方差分析或Kruskal-Wallis H檢驗；計數(shù)資料的組間比較采用卡方檢驗。正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Pearson相關(guān)系數(shù)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Spearman相關(guān)系數(shù)評價變量間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

患者一般情況56例FSGS伴急性腎小管間質(zhì)損傷患者的臨床資料見表1，其中以男性居多(占71.4%)。根據(jù)急性腎小管間質(zhì)損傷程度分組，輕度組22例(39.29%)，中度組18例(32.14%)，重度組16例(28.57%)。重度組與輕中度組患者相比，病程更長,尿NAG、SCr明顯升高(P<0.05)。三組間蛋白尿并無差別。

腎組織TSP-1及SIRPα的表達(dá)正常腎組織中TSP-1免疫組化染色陰性(圖1A)，F(xiàn)SGS伴急性腎小管間質(zhì)損傷患者TSP-1陽性表達(dá)主要集中于近端腎小管上皮細(xì)胞(圖1B)。切片掃描后，經(jīng)過計算得出TSP-1表達(dá)陽性率見表2，急性腎小管間質(zhì)損傷輕度組為14.41%±6.18%，中度組為10.03%±6.61%，重度組為13.78%±8.48%，不同組間TSP-1表達(dá)陽性率無明顯差異。正常腎臟組織中，SIRPα在腎小管間質(zhì)及腎小球均有表達(dá)(圖1C)，其表達(dá)陽性率與FSGS伴不同程度急性腎小管間質(zhì)損傷患者比較無明顯差異(表2)。

表1 局灶節(jié)段性腎小球硬化伴不同程度急性腎小管間質(zhì)損傷患者的臨床資料比較

NAG:N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶；RBP:視黃醇結(jié)合蛋白；AKI：急性腎損傷；△：輕度組vs中度組，P<0.05；#：中度組vs重度組，P<0.05；*：輕度組vs重度組，P<0.05

圖1 免疫組化染色TSP-1與SIRPα在正常(A、C，×200)及FSGS伴急性腎小管間質(zhì)損傷(B、D，×200)腎組織中的表達(dá)TSP-1：血小板反應(yīng)蛋白1；SIRPα:信號調(diào)節(jié)蛋白α;FSGS:局灶節(jié)段性腎小球硬化

TSP-1表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性TSP-1表達(dá)陽性率與臨床指標(biāo)進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析結(jié)果見表3。TSP-1表達(dá)陽性率與病程、尿RBP、尿蛋白定量、SCr呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。TSP-1表達(dá)陽性率與年齡、尿NAG、Alb、血脂無相關(guān)性。

將FSGS伴急性腎小管間質(zhì)損傷的患者根據(jù)TSP-1表達(dá)陽性率分為兩組，<10%分為TSP-1低表達(dá)組20例(35.71%)；≥10%為TSP-1高表達(dá)組36例(64.29%)。兩組患者臨床及實驗室指標(biāo)的比較見表4。TSP-1低表達(dá)組的病程、尿蛋白定量、SCr和尿RBP均明顯高于高表達(dá)組。其他指標(biāo)兩組間無顯著差異。

表2 TSP-1與SIRPα腎小管表達(dá)陽性率比較

TSP-1：血小板反應(yīng)蛋白1；SIRPα:信號調(diào)節(jié)蛋白α；#：與正常對照組比較，P<0.01

表3 TSP-1陽性率與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

TSP-1：血小板反應(yīng)蛋白1；NAG：N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶；RBP：視黃醇結(jié)合蛋白

表4 TSP-1表達(dá)低組與高組臨床指標(biāo)比較

TSP-1：血小板反應(yīng)蛋白1；NAG：N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶；RBP：視黃醇結(jié)合蛋白

討 論

FSGS作為腎病綜合征的常見病因之一，占原發(fā)性腎小球疾病的比例近年呈上升趨勢，本中心發(fā)現(xiàn)，2003年至2014年對比1979年至2002年從6.00%上升到7.34%[8]。FSGS的病理類型具有多樣性，其臨床表現(xiàn)及對治療的反應(yīng)不一，成為導(dǎo)致ESRD的常見原發(fā)性腎小球疾病之一[9]。FSGS作為足細(xì)胞損傷的疾病， 臨床上常伴AKI[2]，病理上常伴不同程度急性腎小管間質(zhì)損傷[1]。本研究選擇病理上均伴急性腎小管間質(zhì)損傷的FSGS病例，以輕度損傷組最多見(39.29%)，其次為中度組(32.14%)，重度組最少(28.57%)。與輕、中度損傷患者相比，重度損傷患者AKI病程較長,尿NAG、SCr較高，病情更嚴(yán)重。而輕度和中度組臨床表現(xiàn)無明顯差別，提示病理損傷嚴(yán)重程度有時和臨床腎功能損傷并不平行，也提示腎活檢的重要性，有利于判斷腎小管間質(zhì)病理損傷的程度，從而指導(dǎo)治療。研究初始，考慮設(shè)置FSGS不伴急性腎小管間質(zhì)損傷一組作為對照，由于本研究選擇的是尿蛋白>3.5 g/d FSGS的病例，實際觀察中發(fā)現(xiàn)這些患者在病理上均伴有不同程度腎小管間質(zhì)急性損傷，很難確定FSGS不伴急性腎小管間質(zhì)損傷，且病例數(shù)少，因此最終未設(shè)置這一組。在嘌呤霉素誘導(dǎo)的微小病變和FSGS模型中，也常伴小管間質(zhì)的急性損傷，因此未設(shè)置病理不伴腎小管間質(zhì)急性損傷的對照組。

已有研究表明腎病綜合征的腎小管間質(zhì)損傷可能是由蛋白尿直接和間接毒性、細(xì)胞因子與生長因子造成的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成分解平衡紊亂等多種原因所介導(dǎo)[10-11]。FSGS患者出現(xiàn)急性腎小管間質(zhì)損傷可能與以上因素相關(guān)，也可能有其他機(jī)制參與。急性損傷時腎小管表達(dá)的分子在其中也可能起到一定作用。

TSP-1作為一種細(xì)胞外基質(zhì)聚糖蛋白，可與不同配體或受體結(jié)合，在細(xì)胞增殖、損傷修復(fù)、炎癥、血管形成過程中發(fā)揮重要作用[6]。動物研究表明，腎臟缺血再灌注所造成的AKI模型，腎小管TSP-1表達(dá)迅速增加[7]。本研究主要觀察FSGS伴急性腎小管間質(zhì)損傷患者腎組織中TSP-1及其受體SIRPα的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)FSGS伴急性腎小管間質(zhì)損傷時，近端腎小管上皮細(xì)胞中TSP-1表達(dá)增加，但在不同程度的急性腎小管間質(zhì)損傷中TSP-1表達(dá)陽性率無顯著差異。提示腎小管間質(zhì)損傷程度和TSP-1表達(dá)陽性率之間似乎不存在明顯相關(guān)性，TSP-1的表達(dá)量不適用于衡量急性腎小管間質(zhì)的損傷程度。既往體外共培養(yǎng)研究提示，TSP-1可通過細(xì)胞間交互作用影響其他細(xì)胞。如成纖維樣基質(zhì)細(xì)胞分泌的TSP-1通過作用于胃癌細(xì)胞上的Intervenolin，抑制胃癌細(xì)胞的增長[12]；基質(zhì)中的TSP-1與內(nèi)皮細(xì)胞的CD47相結(jié)合會影響NO合成，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[13]。所以，在FSGS伴急性腎小管間質(zhì)損傷過程中，TSP-1作為一種細(xì)胞外基質(zhì)，由腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生后，可能不僅作用于腎小管上皮細(xì)胞，還可能通過與配體的結(jié)合，作用于管周毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞等其他細(xì)胞，并介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，隨著時間的偏移，最終可能導(dǎo)致管周毛細(xì)血管的減少，影響間質(zhì)纖維化。但是在人體內(nèi)標(biāo)本中探討腎小管分泌的TSP-1對其他細(xì)胞的作用存在一定難度，需要進(jìn)一步體外和動物實驗來研究證實。

我們進(jìn)一步觀察TSP-1的受體SIRPα在FSGS伴急性腎小管間質(zhì)損傷中的表達(dá)。正常腎臟組織中SIRPα的表達(dá)量與FSGS伴不同程度急性腎小管間質(zhì)損傷相比較，無明顯差異，提示FSGS患者發(fā)生急性腎小管間質(zhì)損傷時，未能觀察到SIRPα表達(dá)量的變化，TSP-1是否可能通過其他受體或者配體介導(dǎo)了這一病理生理過程，需要進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)TSP-1表達(dá)陽性率與病程、尿RBP、尿蛋白定量、SCr成負(fù)相關(guān)。并且按照TSP-1表達(dá)陽性率將患者分為TSP-1表達(dá)低組和TSP-1表達(dá)高組，發(fā)現(xiàn)TSP-1表達(dá)低組病程較長，尿蛋白定量、血肌酐、尿RBP均顯著高于TSP-1表達(dá)高組。提示在病程初期，也就是損傷的早期，SCr尚處于低水平時，腎臟組織TSP-1表達(dá)升高，隨著病程時間延長，TSP-1表達(dá)下降。這與動物實驗中，利用腎臟缺血再灌注損傷模擬AKI時，TSP-1在缺血再灌注3h即有表達(dá)升高，但在24h卻表達(dá)下降[7]，并且在24h，TSP-1的表達(dá)量與SCr成負(fù)相關(guān)的結(jié)果相吻合[14]。推測TSP-1表達(dá)量的上升可作為反映早期急性腎小管間質(zhì)損傷新的組織學(xué)指標(biāo)。

本研究是回顧性研究，未檢測FSGS伴急性腎小管間質(zhì)損傷患者血液及尿液中TSP-1表達(dá)量變化。因為在血液中，TSP-1主要由血小板的α顆粒貯存及分泌，當(dāng)凝血過程啟動，血小板則被激活，會釋放其α顆粒內(nèi)貯存的TSP-1。且有研究表明血清作為凝血過程啟動的產(chǎn)物，其TSP-1濃度顯著高于血漿，約為血漿的100倍，反映的是血小板釋放的TSP-1的量，并不能作為有意義的循環(huán)中TSP-1的濃度[15]。故尚不能利用外周血和尿中TSP-1濃度的變化，作為發(fā)生急性腎小管間質(zhì)損傷的早期指標(biāo)。

小結(jié)：本研究初次探討了在FSGS伴急性腎小管間質(zhì)損傷患者腎組織中TSP-1的表達(dá)變化及意義。FSGS伴急性腎小管間質(zhì)損傷時腎小管TSP-1表達(dá)升高，表達(dá)陽性率的高低與腎功能損傷程度相關(guān)。