小豆皂苷提取和液質(zhì)聯(lián)用檢測方法的優(yōu)化

侯亞楠，王思堯，魏朝俊，楊 凱，萬 平*

(1.北京農(nóng)學院植物科學技術(shù)學院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室； 2. 北京農(nóng)學院生物與資源環(huán)境學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室；北京 102206)

小豆(Adzuki bean，Vignaangularis)，俗稱紅小豆、赤豆、赤小豆，起源于中國，栽培歷史悠久[1]。全球有30多個國家種植小豆，中國的栽培面積和總產(chǎn)量居世界首位[2-3]。小豆營養(yǎng)豐富，含有三萜、多酚、類黃酮等生物活性物質(zhì)。三萜類化合物對植物生長發(fā)育和抗逆有重要作用，植物中已發(fā)現(xiàn)20 000多種三萜類化合物[4-5]；三萜還具有抗血小板、抗腫瘤、抗病毒、降低膽固醇、消炎及作為免疫佐劑等生理活性，在醫(yī)藥衛(wèi)生和保健方面有著較大的應(yīng)用潛力，近年來成為國內(nèi)外生物和醫(yī)藥研究領(lǐng)域關(guān)注的熱點之一[6-7]。

小豆中的三萜皂苷是祛濕、消腫、抗炎的主要活性成分[8]。已報道小豆中有10種小豆皂苷[9-11]；其中的4種皂苷因含有2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮基團(2,3-dihydro-2,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one，DDMP)，易受熱分解難以提取分離[10]，所以相關(guān)研究極少。已分離的6種小豆皂苷均屬于齊墩果烷型的三萜化合物，分別是小豆皂苷I(Azukisaponin I)、小豆皂苷II(Azukisaponin II)、小豆皂苷III(Azukisaponin III)、小豆皂苷IV(Azukisaponin IV)、小豆皂苷V(Azukisaponin V)和小豆皂苷VI(Azukisaponin VI)[9]；它們的總提取物對胰脂肪酶活性有抑制作用，并且抑制α-葡萄糖酶活性的能力高于大豆、綠豆、豇豆、利馬豆、豌豆、蠶豆和小扁豆[12]。

小豆皂苷提取方法有索氏提取法和浸泡法[8,12-13]，但均溶劑消耗大、工藝復(fù)雜、成本高、無法滿足多材料樣本的提取。有報道超聲波輔助浸泡法具有效率高、時間短、成本低廉、操作方便等優(yōu)點[14]，該方法已應(yīng)用于小扁豆、大豆、羽扇豆和葫蘆巴的總皂苷提取[15]，但在小豆中未見相關(guān)應(yīng)用。本試驗首次把超聲波輔助浸泡法應(yīng)用于小豆皂苷提取，并對索氏提取法和超聲波輔助浸泡法的提取效率進行比較。

由于小豆皂苷I、小豆皂苷II、小豆皂苷III、小豆皂苷IV、小豆皂苷V和小豆皂苷VI這6種小豆皂苷沒有標準品出售，無法分別檢測，閆婕等以齊墩果酸為標準品，采用紫外分光光度法測定小豆總皂苷含量[8]，但由于這6種小豆皂苷的結(jié)構(gòu)相似，紫外吸收波段相近，紫外分光光度法無法對其逐一定量分析。已有用液質(zhì)聯(lián)用檢測小豆皂苷[13]，但仍未見用超高效液質(zhì)聯(lián)用儀測定小豆皂苷的報道。本試驗參考液質(zhì)聯(lián)用測定方法，開拓超高效液質(zhì)聯(lián)用檢測小豆皂苷，優(yōu)化洗脫梯度和條件，提高檢測效率。小豆皂苷的提取、標準品制備和超高效液質(zhì)聯(lián)用檢測方法的優(yōu)化，將為小豆種質(zhì)資源中小豆皂苷成分含量測定、小豆皂苷高含量種質(zhì)資源的篩選及育種應(yīng)用、小豆皂苷代謝途徑優(yōu)異基因發(fā)掘利用、小豆皂苷藥理研究提供高效實用的檢測技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

小豆品種‘京農(nóng)6號’，由北京農(nóng)學院選育。

1.2 方 法

1.2.1 磨粉 用高速萬能粉碎機(YW-100，天津市泰斯特儀器有限公司)將‘京農(nóng)6號’籽粒磨粉(1 200 r/min)，過篩(150 μm)，40 ℃烘干至恒重，備用。

1.2.2 樣品溶液的制備 稱取 0.40 g豆粉置于10 mL試管中，加入 8 mL 90% 甲醇，40 ℃、40 KHz超聲提取90 min(PS-60AD，深圳市科潔超聲科技有限公司)，提取液0.45 μm膜過濾后供檢測分析。稱取1.00 g豆粉放入濾紙包內(nèi)，將濾紙包置于提取管中，向250 mL圓底燒瓶中加入100 mL甲醇回流提取3 次(每次1 h )，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000E，上海霓玥儀器有限公司)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇溶解并定容至20 mL，0.45 μm膜過濾供檢測分析。

1.2.3 色譜與質(zhì)譜條件 測定儀器為三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent 1290-G6470)，該系統(tǒng)配備Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱2.1 mm×50 mm，1.8 μm， 流動相為0.1%甲酸/水(A)和乙腈(B)。簡化洗脫條件為10% 乙腈至100% 乙腈 5 min線性梯度洗脫。柱溫25 ℃，流速0.4 mL/min，進樣量1 μL。電噴霧質(zhì)譜(electrospray ionization-mass spectrometric，ESI-MS)分析，采用電離電壓3 500 V，源溫度350 ℃電噴霧電離；氮氣35 psi，氣體流速 10 L/min，負離子模式下對m/z760到m/z1140進行全掃描(MS2 scan)。在選擇離子監(jiān)測(SIM，Selected Ion Monitoring)檢測方式下，檢測兩種提取方法所得提取物的分子離子。在碎片離子掃描(Product Ion Scan)方式下，檢測提取物的碎片離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 小豆皂苷分子離子定性分析

根據(jù)6種小豆皂苷的分子量，確認提取物中存在小豆皂苷I、小豆皂苷II、小豆皂苷III、小豆皂苷IV、小豆皂苷V和小豆皂苷VI，在小豆提取物的超高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜(Ultra Performance Liquid Chromatography-electrospray Ionization Mass Spectrometric，UPLC-ESI-MS)的總離子色譜圖中標記小豆皂苷的6個峰(圖1)。簡化洗脫條件后，5 min內(nèi)完成檢測，節(jié)省流動相并提高檢測效率。

注：1是小豆皂苷IV；2是小豆皂苷VI；3是小豆皂苷V；4是小豆皂苷II；5是小豆皂苷I；6是小豆皂苷III。Note:1 is Azukisaponin IV; 2 is Azukisaponin VI; 3 is Azukisaponin V; 4 is Azukisaponin II; 5 is Azukisaponin I; 6 is Azukisaponin III.圖1 小豆提取物的UPLC-ESI-MS總離子色譜圖Fig.1 UPLC-ESI-MS total ion chromatograms of adzuki bean total extract

2.2 小豆皂苷碎片離子定性分析

通過比較保留時間、UPLC-ESI-MS 鑒定(圖1)和ESI-MS2(圖2)，峰1是小豆皂苷IV；峰2是小豆皂苷VI；峰3是小豆皂苷V；峰4是小豆皂苷II；峰5是小豆皂苷I；峰6是小豆皂苷III(表1)。

表1 小豆中鑒定6種小豆皂苷的UPLC-ESI-MS2數(shù)據(jù)Tab.1 UPLC-ESI-MS2 data of identification of six azukisaponins in adzuki bean

2.3 兩種提取方法的相對含量分析

以選擇離子監(jiān)測方式檢測的小豆皂苷積分面積為評價指標，超聲波輔助浸泡法提取的6種小豆皂苷的得率優(yōu)于索氏提取法，提取時間、提取液體積小于索氏提取法(表2)。采用超聲波輔助浸泡法可提高小豆皂苷得率，縮短提取時間，節(jié)省溶劑。

表2 超聲波輔助浸泡法與索氏提取法的比較(n=6)Tab.2 Comparison of extraction efficiency of sixazukisaponins by soxhlet extraction and ultrasonic-assisted extraction(n=6)

3 討 論

索氏提取法具有得率高、準確等特點，但索氏提取法提取時間長和成本高，難以應(yīng)用于大量樣本的提取。本試驗比較索氏提取法和超聲波輔助浸泡法的得率，表明超聲波輔助浸泡法提取的6種小豆皂苷的得率優(yōu)于索氏提取法，且省時、成本低、操作方便，適合用于大規(guī)模種質(zhì)資源樣本的小豆皂苷制備提取。

圖2 6種小豆皂苷質(zhì)譜圖Fig.2 ESI (-) MS, MS2 spectra of identified six azukisaponins in adzuki bean

近年，高效液相色譜法開始廣泛用于三萜類化合物的定量和定性分析上[20]。Liu等使用Agilent 1100系列高效液相色譜儀檢測9種小豆類黃酮和6種小豆皂苷，使用10 mmol/L乙酸銨和乙腈進行梯度洗脫。初始條件為10%乙腈 10 min，30 min 變?yōu)?5%乙腈，45 min變?yōu)?5%乙腈，55 min變?yōu)?5%乙腈，60 min時45%乙腈, 70 min時55%乙腈。分析時間為90 min，其中小豆皂苷分析時間為25 min[13]。本試驗使用Agilent 1290-G6470三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，簡化洗脫條件為10% 乙腈至100% 乙腈10 min線性梯度洗脫，在5 min內(nèi)完成對6種小豆皂苷的分離及測定，顯著提高檢測效率。

本試驗建立小豆超聲波輔助浸泡提取6種小豆皂苷的方法、確定超高效液質(zhì)聯(lián)用檢測6種小豆皂苷的方法，為小豆皂苷提取、標樣制備和檢測提供高效技術(shù)方法，為進一步篩選小豆皂苷高含量的種質(zhì)資源和生物強化育種利用以及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。