豬細(xì)小病毒病毒樣顆粒的制備及其免疫評價(jià)

陳玉梅，周景明，劉東民，馬麗萍，馮 景，劉運(yùn)超

(1.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001； 2.河南中澤生物工程有限公司，河南 鄭州 450000)

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)為無囊膜的單鏈線狀DNA病毒，二十面體等軸立體對稱結(jié)構(gòu)(T=1)，病毒粒子呈六角形或圓形，平均直徑20～26 nm，分子質(zhì)量為5.3×106u，主要引起母豬的繁殖障礙，導(dǎo)致懷孕母豬的死胎和木乃伊胎、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征等[1-2]。PPV在我國流行極為廣泛，豬場檢測病毒陽性率極高，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。PPV 基因組包括2個(gè)開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2 和NS3；ORF2 主要編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2 和VP3，它們的分子質(zhì)量依次是83 ku、64 ku和60 ku[4-6]。VP1和VP2是從一組嵌套的編碼序列中翻譯出來的，較小的VP2是從與較大的VP1相同的RNA模板中剪接產(chǎn)生的，只是它們的氨基末端不同，而VP3是VP2的翻譯后修飾產(chǎn)物。VP1蛋白大約占病毒粒子10%，主要在病毒復(fù)制和感染細(xì)胞時(shí)發(fā)揮作用，VP2蛋白是PPV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，約占病毒衣殼蛋白總量的60%以上，包含PPV主要的B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位[7]。

目前，接種PPV疫苗仍是預(yù)防豬細(xì)小病毒感染的主要手段之一[8]。PPV疫苗的發(fā)展經(jīng)歷了弱毒苗到滅活苗的過程，出于對疫苗本身安全性的考慮，弱毒疫苗的毒株和滅活疫苗的滅活手段也在不斷改進(jìn)，但是弱毒疫苗毒力返強(qiáng)和滅活疫苗滅活失敗的危險(xiǎn)，始終是困擾現(xiàn)有PPV疫苗防治策略的一個(gè)重要問題[7]。同時(shí)，長期、大劑量、多頻次PPV疫苗免疫給豬場的生產(chǎn)帶來很大的經(jīng)濟(jì)和勞動(dòng)量負(fù)擔(dān)。通過系統(tǒng)研究野外分離株中VP蛋白的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)了PPV新的變異株，傳統(tǒng)的PPV疫苗株的抗血清不能有效中和這些病毒[9]。PPV的變異給豬場PPV的防控帶來新的壓力，而一種安全、高效的疫苗對PPV的清除工作尤其關(guān)鍵。重組表達(dá)的VP2蛋白能自我裝配成病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)，是良好的抗原轉(zhuǎn)運(yùn)載體，并且能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，因此，VP2蛋白對研究PPV疫苗具有很高的價(jià)值[6-7]。ANTONIS等[10]將PPVVP2基因成功克隆至桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，并在體外成功獲得PPV VLPs，其免疫豚鼠和豬均能產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。另外，國內(nèi)外多個(gè)研究機(jī)構(gòu)采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備了VLPs，且該VLPs能夠保護(hù)豚鼠抵抗PPV感染[11-15]?？梢?，PPV VP2在真核表達(dá)系統(tǒng)中能夠順利地形成VLPs結(jié)構(gòu)，但是表達(dá)量較低，難以產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。而采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP2量較高，卻難以實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，更難于形成VLPs結(jié)構(gòu)。目前在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得高活性的PPV VP2蛋白仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)，司艷紅等[16]將PPVVP2基因克隆到pET32a上，在E.coli中成功表達(dá)了以包涵體形式存在的VP2與Trx-His-tag的融合蛋白，經(jīng)復(fù)性處理后未能得到VLPs。鑒于此，采用改進(jìn)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)獲得可溶性PPV VP2蛋白，經(jīng)體外裝配形成VLPs，通過進(jìn)一步研究VLPs疫苗刺激昆明鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答效果，分析VLPs刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體、血凝抑制抗體及中和抗體的情況，比較PPV VLPs疫苗與商品化滅活疫苗的免疫效果，為PPV VLPs疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 載體、細(xì)胞、病毒及供試動(dòng)物

pET28a等質(zhì)粒和菌種均由鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院抗體工程與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。伴侶蛋白Tf16表達(dá)質(zhì)粒購自TaKaRa公司。

PK-15細(xì)胞及PPV-7909標(biāo)準(zhǔn)毒株由鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院抗體工程與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并保存。

供試動(dòng)物：20只4周齡健康雌性昆明鼠購買自河南省鄭州市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑

Prime STAR Max DNA Polymerase、BamH Ⅰ、XhoⅠ、T4 DNA Ligase等分子生物學(xué)試劑均購自TaKaRa公司；Anti-6×His-tag antibody購自Proteintech公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自Abcam公司；IPTG、卡那霉素(Kan)、氯霉素(Cm)、L-阿拉伯糖等試劑均購自索萊寶科技有限公司；Ni-NTA親和層析填料(Ni2+柱)購自Norvagen公司；Universal DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司；BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自Thermo公司；胰酶、FBS購自Gibco公司，弗氏完全/不完全佐劑購自Sigma公司。

1.3 PPV VP2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以PPV的疫苗株WH-1株為研究對象，在GenBank中查詢PPV VP2蛋白序列(China株，AY5883318)，分析PPV VP2的基因和氨基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏愛性，同時(shí)兼顧GC含量、mRNA的二級結(jié)構(gòu)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和chi位點(diǎn)、限制性酶切位點(diǎn)等信息，優(yōu)化并合成PPV VP2蛋白的基因。設(shè)計(jì)1對特異性引物，F(xiàn)：GGATCCATGTCGGAAAATGTGGAACA(BamH Ⅰ)。R：CCTCGAGTTAATACAGTTTCCGTGGAATGA(XhoⅠ)。將優(yōu)化合成的PPVVP2基因經(jīng)BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切后亞克隆至原核表達(dá)載體pET28a中，經(jīng)菌液PCR、雙酶切鑒定后送樣測序，測序結(jié)果用DNAStar軟件進(jìn)行分析。將測序正確的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用于重組蛋白表達(dá)。

1.4 分子伴侶共表達(dá)菌株的構(gòu)建

將含有陽性重組載體pET28a-VP2的BL21菌株制成感受態(tài)細(xì)胞，將伴侶蛋白質(zhì)粒pTf16轉(zhuǎn)化上述感受態(tài)細(xì)胞，涂布含Kan+/Cm+雙抗性的固體LB培養(yǎng)基上，倒置37 ℃恒溫過夜。挑選6個(gè)單克隆接種于含Kan+/Cm+雙抗性液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，篩選共表達(dá)陽性轉(zhuǎn)化子。

1.5 重組蛋白初步表達(dá)與可溶性分析

分別將含pTf16與不含pTf16的pET28a-VP2表達(dá)菌體按 1∶1 000比例接種于Kan+/Cm+LB培養(yǎng)液中，37 ℃、220 r/min 過夜培養(yǎng)活化，將活化菌體按 1∶100比例接種于含Kan+/Cm+雙抗性的LB培養(yǎng)液中，37 ℃、220 r/min 培養(yǎng)2 h。當(dāng)OD600為0.6～0.8，將含pTf16質(zhì)粒的pET28a-VP2表達(dá)菌中加入終質(zhì)量濃度為 2 mg/mL的L-阿拉伯糖和0.5 mmol/L的IPTG，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；不含pTf16的表達(dá)菌只加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。收集誘導(dǎo)后菌體并分別進(jìn)行超聲破碎，SDS-PAGE及Western blot分析表達(dá)產(chǎn)物。

1.6 重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

分別從誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度、質(zhì)量濃度等方面進(jìn)行了優(yōu)化，誘導(dǎo)溫度分別設(shè)為16、25、30、37 ℃，0.5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)10 h；IPTG濃度分別選擇0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mmol/L 5個(gè)梯度(在最佳溫度條件下誘導(dǎo)8 h篩選)；共設(shè)置6、12、16、20 h 4個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間收獲菌體(在IPTG濃度為0.5 mmol/L、最佳溫度下誘導(dǎo))。分別用12%分離凝膠進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，以確定重組蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。

1.7 重組表達(dá)蛋白的純化

樣品前處理：收集誘導(dǎo)表達(dá)菌體，用pH值8.0的50 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl緩沖液重懸后，進(jìn)行超聲破碎，12 000 r/min離心30 min，取超聲上清用于純化；分別用20%、30%、40%及50%的(NH4)2SO4沉淀對表達(dá)的重組PPV VP2蛋白進(jìn)行粗純，經(jīng)SDS-PAGE分析粗純效果；經(jīng)透析除去(NH4)2SO4，再選用Ni2+柱進(jìn)行親和層析純化，采用咪唑濃度梯度洗脫法，用SDS-PAGE、Western blot檢測重組蛋白純度，BCA法測定重組蛋白含量。

1.8 PPV VLPs組裝及檢測

1.8.1 組裝 在獲得高純度PPV VP2蛋白的基礎(chǔ)上優(yōu)化VLPs裝配緩沖液條件，研究 VP2蛋白在體外組裝成VLPs的條件，用pH值8.0的50 mmol/L Tris-HCl作為基礎(chǔ)緩沖液，分別選擇NaCl濃度為50、100、150、200、250 mmol/L 5個(gè)梯度，探討鹽離子濃度對VLPs結(jié)構(gòu)組裝效率、穩(wěn)定性的影響。

1.8.2 形成情況檢測 通過透射掃描電鏡(TEM)以及動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(DLS)觀察VLPs形成情況。

1.8.3 血凝活性檢測 采用血凝試驗(yàn)測定VLPs的血凝活性，取96孔V型板，每孔加入PBS 25 μL，將VLPs進(jìn)行系列倍比稀釋，至11孔后吸取25 μL棄去，第12孔為PBS對照組，稀釋后每孔再加入PBS 25 μL，最后每孔加入25 μL 1%小鼠紅細(xì)胞懸液，微量振蕩器輕微振蕩搖勻，置于室溫(20～25 ℃)，靜止1 h后判定結(jié)果，以能使100%紅細(xì)胞凝集的VLPs最高稀釋倍數(shù)作為判定終點(diǎn)。

1.9 VLPs的免疫評價(jià)

1.9.1 免疫程序 選取20只健康的昆明鼠隨機(jī)分成4組，每組5只： A組免疫30 μg VLPs；B組免疫15 μg VLPs；C組免疫PPV滅活苗100 μL；D組為PBS對照組，免疫100 μL PBS。與佐劑分別配比后乳化免疫鼠(皮下多點(diǎn)注射)，首免用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫選用弗氏不完全佐劑，首免后14 d加強(qiáng)免疫一次。免疫后0、7、14、21、28、35、42、49、56 d斷尾采血收集血清，采用ELISA、血凝抑制試驗(yàn)(HI)和病毒中和試驗(yàn)(VN)檢測小鼠的抗體應(yīng)答情況。

1.9.2 ELISA測定抗體效價(jià) 用碳酸鹽緩沖液(CBS)將純化的VLPs稀釋成2 μg/mL，按50 μL/孔的量加入96孔ELISA板內(nèi)，4 ℃包被過夜； PBST洗3次，含5%脫脂奶粉的封閉液37 ℃封閉2 h；PBST洗3次，一抗用待檢血清，以1∶100開始按2倍倍比稀釋(1∶100、1∶200……1∶102 400)，二抗用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)，測定抗體效價(jià)。

1.9.3 HI檢測 配制4個(gè)100%血凝單位(即4HA100)VLPs與倍比稀釋的待檢血清(1∶100、1∶200……1∶102 400)等體積混勻，每孔50 μL加入96孔血凝板，再加入50 μL 1%小鼠紅細(xì)胞懸液，搖勻，室溫放置1 h；判定結(jié)果：HI效價(jià)即為完全抑制4HA100單位抗原凝集的血清最高稀釋度。

1.9.4 病毒中和試驗(yàn) 提前將PK15細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中；隨即稀釋PPV懸液至200個(gè)TCID50；將待檢血清每孔按50 μL在新的96孔板上做2倍連續(xù)倍比稀釋(1∶10、1∶20……1∶5 120)，隨后與稀釋好的病毒懸液1∶1混合，放置1 h；將病毒與血清混合液感染PK15細(xì)胞；觀察細(xì)胞病變情況，計(jì)算血清的中和抗體效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPV VP2蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組蛋白的表達(dá)分析

以優(yōu)化合成的VP2基因?yàn)槟０?，?yīng)用高保真預(yù)混酶Prime STAR Max DNA Polymerase對VP2序列進(jìn)行擴(kuò)增，將其插入pET28a載體構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-VP2，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞；經(jīng)菌液PCR、雙酶切鑒定及測序證實(shí)后的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)并制成感受態(tài)細(xì)胞，將伴侶蛋白質(zhì)粒pTf16轉(zhuǎn)化上述感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Kan+/Cm+雙抗性固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑選6個(gè)單克隆于Kan+/Cm+雙抗LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)篩選共表達(dá)陽性轉(zhuǎn)化子。共表達(dá)菌經(jīng)IPTG及L-阿拉伯糖初步誘導(dǎo)后，收集菌體經(jīng)超聲破碎后用SDS-PAGE及Western blot進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，在可溶性上清和沉淀中均檢測到大小約64 ku的目的蛋白(圖1A)，當(dāng)與伴侶蛋白Tf16共表達(dá)時(shí)，VP2蛋白的可溶性表達(dá)量明顯增加(圖1B)，其中圖1B中第3孔在約56 ku位置的蛋白是伴侶蛋白Tf16。

2.2 重組VP2蛋白的表達(dá)條件優(yōu)化

為了進(jìn)一步提高重組VP2蛋白的可溶性表達(dá)量，分別從誘導(dǎo)時(shí)間、溫度、IPTG濃度對表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，SDS-PAGE結(jié)果顯示，25 ℃和30 ℃誘導(dǎo)時(shí)重組VP2蛋白可溶性表達(dá)量最高，選擇30 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)(圖2A)；而IPTG濃度變化對目的蛋白可溶性表達(dá)量的影響并不大，故選擇低劑量的0.1 mmol/L作為最佳濃度(圖2B)；誘導(dǎo)表達(dá)12 h時(shí)重組VP2蛋白可溶性表達(dá)量已達(dá)最高，繼續(xù)培養(yǎng)目的蛋白的含量并沒有明顯提高(圖2C)。綜上，最終得出目的蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件：0.1 mmol/L IPTG在 30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h,可獲得較高表達(dá)量的可溶性VP2蛋白。

2.3 重組蛋白VP2的純化

采用硫酸銨沉淀法進(jìn)行第一步純化，SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組VP2蛋白在硫酸銨含量為20%時(shí)已經(jīng)開始出現(xiàn)沉淀，到40%時(shí)可完全沉淀(圖3A)，所以本研究采用40%硫酸銨對重組VP2蛋白進(jìn)行純化。用Tris-HCl緩沖液溶解后，透析除去硫酸銨，再進(jìn)行Ni2+親和層析純化，經(jīng)咪唑梯度洗脫分離純化重組VP2蛋白，SDS-PAGE及Western blot檢測結(jié)果表明，經(jīng)二步法純化獲得的重組VP2蛋白的純度約為90%(圖3B)。

A：M.Marker； 1、3、5、7分別為16、25、30、37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)后的超聲上清；2、4、6、8分別為16、25、30、37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)后的超聲沉淀。B：M.Marker； 1、3、5、7分別為IPTG濃度為0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)后的超聲上清；2、4、6、8分別為IPTG濃度為0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)后的超聲沉淀。C：M.Marker； 1、3、5、7分別為誘導(dǎo)6、12、16、20 h的超聲上清; 2、4、6、8分別為誘導(dǎo)6、12、16、20 h的超聲沉淀A：M.Marker; 1,3,5,7 represent ultrasonic supernatant induced at 16 ℃,25 ℃,30 ℃ and 37 ℃,respectively; 2,4,6,8 represent ultrasonic precipitation induced at 16 ℃,25 ℃,30 ℃ and 37 ℃,respectively. B：M.Marker; 1,3,5,7 represent ultrasonic supernatant induced at the IPTG concentration of 0.1,0.3,0.5,0.7 mmol/L,respectively; 2,4,6,8 represent ultrasonic precipitation induced at the IPTG concentration of 0.1,0.3,0.5,0.7 mmol/L,respectively. C：M.Marker; 1,3,5,7 represent ultrasonic supernatant induced at 6 h,12 h,16 h and 20 h,respectively; 2,4,6,8 represent ultrasonic precipitation induced at 6 h,12 h,16 h and 20 h,respectively

A:硫酸銨沉淀初步純化VP2蛋白。M.Marker；1—4.分別為20%、30%、40%及50% (NH4)2SO4沉淀。B: Ni2+親和層析純化VP2蛋白。 M.Marker；1—2.Ni2+純化的VP2蛋白A: (NH4)2SO4 purification of VP2 protein. M.Marker; 1—4.20%,30%,40% and 50% (NH4)2SO4 precipitation. B: Ni2+ affinity chromatography.M.Marker; 1—2.Ni2+purification of VP2 protein

2.4 PPV VLPs組裝和檢測

分析NaCl濃度對VP2組裝形成VLPs的影響，通過透射掃描電鏡(TEM)(圖4A)以及動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(DLS)(圖4B)觀察VLPs形成情況，結(jié)果顯示，從大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組VP2蛋白可以在體外組裝形成結(jié)構(gòu)相對較均一、大小約20 nm的VLPs，pH值8.0的Tris緩沖液中，當(dāng)NaCl濃度為150 mmol/L時(shí)VLPs組裝效率最高。檢測VLPs的血凝活性，證實(shí)制備的VLPs血凝效價(jià)為1∶1 024(圖4C)，說明該VLPs正確展示了PPV的血凝活性表位，結(jié)構(gòu)接近天然PPV病毒。

A：電鏡結(jié)果；B：動(dòng)態(tài)光散射結(jié)果；C：血凝試驗(yàn)結(jié)果(VLPs稀釋倍數(shù)分別從1∶8到1∶1 024)A:The results of electron microscopy; B:The results of dynamic light scattering; C:The results of Hemagglutination test(Dilution ratio of VLPs is from 1∶8 to 1∶1 024,respectively)圖4 PPV VLPs組裝和檢測 Fig.4 Assembly and inspection of PPV VLPs

2.5 PPV VLPs免疫效果

采用ELISA檢測昆明鼠的抗體應(yīng)答情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VLPs組免疫血清特異性抗體效價(jià)最高可達(dá)1∶25 600，高劑量組略高于低劑量組；無論是高劑量還是低劑量組,抗體水平均略高于滅活疫苗組(圖5)。

圖5 免疫血清效價(jià)ELISA測定 Fig.5 The immunity serum titer measured by ELISA

病毒中和試驗(yàn)顯示，VLPs能有效刺激小鼠產(chǎn)生較高效價(jià)的中和抗體，在免疫后35 d，A組高劑量免疫組(VLPs 30 μg)的抗體水平略高于B組低劑量組(VLPs 15 μg)，而在免疫后42 d時(shí)低劑量組中和抗體水平則略高于高劑量組；PPV滅活疫苗組和PBS免疫組都幾乎沒有中和抗體的產(chǎn)生(圖6A)。VLPs免疫后，15 μg VLPs比30 μg VLPs免疫組的HI抗體水平高，而PPV滅活苗免疫組幾乎沒有HI抗體產(chǎn)生，PBS免疫對照組在整個(gè)免疫期都沒有HI抗體的產(chǎn)生(圖6B)。

圖6 免疫血清中和抗體和HI抗體檢測 Fig.6 Detection of neutralizing antibody and HI antibody

3 結(jié)論與討論

原核表達(dá)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)目的蛋白的高效表達(dá)、降低生產(chǎn)成本，在獸用疫苗市場有廣泛應(yīng)用前景。PPV VP2蛋白在體外經(jīng)重組表達(dá)后能自我裝配成VLPs結(jié)構(gòu)，能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。因此，實(shí)現(xiàn)VP2蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)的高效可溶性表達(dá)對PPV VLPs疫苗研究具有重要意義。國內(nèi)外學(xué)者在原核表達(dá)PPV VP2 蛋白上開展了一系列研究，司艷紅等[16]在E.coli中成功表達(dá)了以包涵體形式存在的VP2融合蛋白，經(jīng)復(fù)性處理后未能得到VLPs；宋品等[17]在E.coli中獲得與SUMO標(biāo)簽融合表達(dá)的PPV VP2蛋白，經(jīng)切除標(biāo)簽獲得VLPs。司艷紅等[16]雖然在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)獲得重組VP2蛋白，但是卻難以實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，更難于形成VLPs結(jié)構(gòu)；宋品等[17]在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得帶有較大融合標(biāo)簽的重組VP2蛋白，但在后續(xù)組裝VLPs過程中，需要切除標(biāo)簽，增加操作難度，提高了VLPs制備成本。本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)成功獲得可溶性PPV VP2蛋白，用DNAStar軟件分析PPV VP2蛋白氨基酸序列，VP2蛋白共含有579個(gè)氨基酸，其分子質(zhì)量約為64.3 ku。SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組VP2蛋白在約64 ku處有明顯目的條帶，通過與伴侶蛋白共表達(dá)的方式可以明顯增加目的蛋白的可溶性表達(dá)量，提高重組蛋白活性。經(jīng)硫酸銨鹽析沉淀和Ni2+柱親和層析2步純化法獲得純度約90%的重組VP2蛋白。由于PPV VLPs形成效率顯著影響VLPs疫苗的免疫保護(hù)效果，經(jīng)VLPs組裝條件的優(yōu)化，本研究發(fā)現(xiàn)，PPV VP2蛋白在pH值 8.0的Tris緩沖液、150 mmol/L NaCl濃度條件下VLPs形成率最高，最終獲得與天然PPV病毒結(jié)構(gòu)類似的VLPs結(jié)構(gòu)，透射電鏡和動(dòng)態(tài)光散射檢測結(jié)果表明，制備的VLPs大小約20 nm，結(jié)構(gòu)均一、形狀規(guī)則，且具有血凝活性，說明該VLPs能夠正確展示PPV的血凝活性表位，與前述桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中獲得的VLPs結(jié)構(gòu)類似[10-15]。進(jìn)一步用PPV VLPs疫苗免疫昆明鼠進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，證明制備的VLPs疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體效價(jià)高達(dá)1∶25 600，說明制備的VLPs疫苗能有效刺激機(jī)體B淋巴細(xì)胞活化，產(chǎn)生明顯優(yōu)于PPV滅活疫苗特異性抗體，有良好的應(yīng)用前景。