黃瓜蠟質(zhì)合成相關(guān)基因CsCER4的克隆與表達(dá)分析

宮思宇，于 越，郭冬雪，杜亞琳，郝 寧，武 濤,

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

植物為了適應(yīng)干燥、高溫、紫外線等惡劣的環(huán)境條件，器官表面進(jìn)化出角質(zhì)層。角質(zhì)層可以限制非氣孔水分流失并限制灰塵沉積在植物表面上，角質(zhì)層也可以保護(hù)植物免受各種生物和非生物脅迫，如害蟲(chóng)、病原體、紫外線輻射、有毒氣體、機(jī)械破裂等,植物表皮角質(zhì)層的2個(gè)主要成分為蠟質(zhì)和角質(zhì)[1]。

目前，植物蠟質(zhì)合成調(diào)控研究取得了較大進(jìn)展[2-4]。C16和C18脂肪酸在細(xì)胞質(zhì)體中從頭合成，在?；?ACP硫解酶作用下被ACP釋放，在?；o酶A合成酶(LACSs)的作用下，轉(zhuǎn)化為脂肪酰輔酶A運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，脂肪酰輔酶A在脂肪酸延伸復(fù)合體(FAE)的催化循環(huán)作用下形成碳鏈長(zhǎng)C24—C36的長(zhǎng)鏈脂肪酸VLCFAs，F(xiàn)AE是由1個(gè)縮合酶、2個(gè)還原酶、1個(gè)脫水酶組成的，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上行使功能[2-3]。VLCFAs是蠟質(zhì)合成的前體物質(zhì)，通過(guò)2種途徑合成蠟質(zhì)的主要成分，一種是初級(jí)醇途徑，VLCFAs在脂酰輔酶A還原酶(FAR)的作用下還原為初級(jí)醇，接著由蠟質(zhì)合成酶WSD催化，形成烷基質(zhì)；另一種是烷烴途徑，VLCFAs在FAR的催化下，還原成醛，再由醛脫羧酶催化生成烷烴，中鏈烷烴羥化酶(MAH1)催化烷烴生成二級(jí)醇，二級(jí)醇在MAH1的作用下生成酮[4]。

擬南芥中已經(jīng)鑒定多個(gè)與表皮蠟質(zhì)合成相關(guān)的基因，如與FAE復(fù)合體相關(guān)的限速酶基因KCS1、KCS2、KCS6、KCS9、KCS20和KCR1[5-10]，參與蠟質(zhì)生物合成的細(xì)胞色素P450酶(CYP96A15)基因[11]，修飾FAR的CER3和WSD1基因[12-13]。研究表明，CER4是編碼FAR的一個(gè)典型基因，其參與了氣生組織表皮蠟質(zhì)中伯醇的形成，在幼根和老根中的表達(dá)量都很低，暗示CER4在表皮蠟質(zhì)C24—C30鏈的形成過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用[14-15]。

除了擬南芥之外，人們?cè)谵r(nóng)作物和園藝作物蠟質(zhì)合成研究方面也取得了較大進(jìn)展[16-28]。GAN等[16]利用日本晴水稻為試驗(yàn)材料，鑒定出蠟質(zhì)代謝合成基因Loc_Os04g40730和Loc_Os03g12030；PU等[25]將甘藍(lán)型油菜中的BnaA.GL基因精確定位到接近染色體A9末端的連鎖群。黃瓜是我國(guó)設(shè)施栽培的主要蔬菜作物之一，表皮蠟質(zhì)是黃瓜表面最外層的保護(hù)物質(zhì)，為黃瓜的一種重要的綜合抗性指標(biāo)[29]。但到目前為止，對(duì)黃瓜表皮蠟質(zhì)的形成調(diào)控還知之甚少。目前只有王文嬌[30]克隆了黃瓜蠟質(zhì)合成的2個(gè)基因CsCER1和CsWax2，研究表明，黃瓜中這2個(gè)基因表達(dá)量異常，影響了黃瓜表皮蠟質(zhì)含量。鑒于擬南芥中CER4基因在蠟質(zhì)形成過(guò)程中主要參與初級(jí)醇途徑，對(duì)蠟質(zhì)的產(chǎn)生不可或缺，因此，為了研究黃瓜蠟質(zhì)合成調(diào)控分子機(jī)制，克隆了擬南芥CER4基因在黃瓜中的同源基因，命名為CsCER4。通過(guò)分析CsCER4基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子和基因的表達(dá)模式，初步預(yù)測(cè)CsCER4在調(diào)控黃瓜表皮蠟質(zhì)形成中的作用，為進(jìn)一步研究其對(duì)黃瓜表皮蠟質(zhì)的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為華南型黃瓜649。2018年5月1日在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽(yáng)農(nóng)場(chǎng)大棚直接播種，常規(guī)管理。分別取葉片 (最頂部幼嫩葉片)、子房(開(kāi)花當(dāng)天)、果皮(開(kāi)花當(dāng)天)、莖(距頂端莖尖下第3個(gè)節(jié)間部分)和雄花(開(kāi)花前1 d)，用液氮冷凍并于-80 ℃保存，備用。

1.2 CsCER4的克隆、測(cè)序及生物信息學(xué)分析

在擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arabidopsis.org/)中，檢索出擬南芥CER4蛋白(AT4G33790)的氨基酸序列，在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://cucurbitgenomics.org/)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選蛋白質(zhì)序列相似性得分最高的蛋白質(zhì)，命名為CsCER4，并以該蛋白質(zhì)編碼基因(Csa6G151800.1)的cDNA序列為模板設(shè)計(jì)引物(上游引物：5′-ATGGTGGTAAATATGATTATCATG-3′，下游引物：5′-TCATTTGAAGATGTGTTTAACTAGT-3′)用于基因克隆。提取黃瓜葉片的總RNA(康為世紀(jì) CWBIO OmniPlant RNA Kit)，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA(康為世紀(jì)HiFiScript cDNA Synthesis Kit)，將得到的cDNA作為模板進(jìn)行CsCER4克隆。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，51.6 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸60 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，進(jìn)行回收、純化(DNA 凝膠回收試劑盒，天根)，送擎科生物工程(哈爾濱)股份有限公司測(cè)序。利用在線軟件對(duì)CsCER4的等電點(diǎn)(pI)、二級(jí)結(jié)構(gòu)及跨膜區(qū)域等進(jìn)行分析。

1.3 CsCER4同源蛋白序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，使用BLAST程序搜索與CsCER4蛋白同源性高的植物蛋白序列。使用DNAMAN軟件將CsCER4蛋白序列和其他同源性高的植物蛋白序列用鄰近相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 CsCER4表達(dá)模式分析

提取649黃瓜的子房、果皮、葉片、莖、雄花等組織的RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA(康為世紀(jì) HiFiScript cDNA Synthesis Kit)，每個(gè)樣本設(shè)計(jì)3次生物學(xué)重復(fù)。以CsCER4基因序列為模板設(shè)計(jì)引物(上游引物：5′-TCAAGCGGCCGTGTTAATGAGC-3′，下游引物：5′-CGTTTGGCTCATCGGAAAGTTGG-3′)用于表達(dá)模式分析。使用 iCycler iQTM5 real-time PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)、SYBR-Green試劑盒(Toyobo)進(jìn)行qRT-PCR。以黃瓜CsActin基因(上游引物：5′-CGCTCTTCTTGCTTTCACCCTT-3′，下游引物：5′-TACCTTGCCTTGGAGTATTTGG-3′)為內(nèi)參。反應(yīng)條件同1.2。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.5 CsCER4啟動(dòng)子元件分析

在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://cucurbitgenomics.org/)搜索CsCER4的啟動(dòng)子序列，利用在線分析軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)CsCER4啟動(dòng)子區(qū)域所含的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsCER4的克隆及序列分析

序列比對(duì)結(jié)果顯示，在黃瓜基因組中與擬南芥CER4蛋白氨基酸序列相似性最高的基因?yàn)镃sa6G151800.1，序列相似性為46.07%，將其編碼基因命名為CsCER4。CsCER4基因?qū)儆贔AR家族。通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序，獲得黃瓜649中CsCER4的cDNA編碼區(qū)序列。CsCER4基因CDS全長(zhǎng)540 bp，包含3個(gè)外顯子、2個(gè)內(nèi)含子，編碼179個(gè)氨基酸(圖 1)。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，CsCER4等電點(diǎn)(pI)為9.79，是堿性蛋白質(zhì)。CsCER4親水性為-0.349,不通過(guò)跨膜區(qū)，在膜外進(jìn)行作用。蛋白質(zhì)氨基酸序列以α-螺旋(48.6%)和無(wú)規(guī)則卷曲(30.73%)為主，延伸鏈(15.64%)和β-轉(zhuǎn)角(5.03%)為輔。

2.2 CsCER4系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，利用BLAST檢索CsCER4在不同植物中的同源蛋白，從檢索結(jié)果中選取了來(lái)自16個(gè)不同物種的16個(gè)同源性高的蛋白質(zhì)序列：甜瓜(Cucumismelo)、南瓜(Cucurbitamoschata)、西葫蘆(Cucurbitapepo)、苦瓜(Momordicacharantia)、番木瓜(Caricapapaya)、山黃麻(Tremaorientale)、花生(Arachishypogaea)、大豆(Glycinemax)、木豆(Cajanuscajan)、豇豆(Vignaunguiculata)、苜蓿(Medicagotruncatula)、棉花(Gossypiumraimondii)、海島棉(Gossypiumbarbadense)、石榴(Punicagranatum)、川桑(Morusnotabilis)、紅車(chē)軸草(Trifoliumpratense)。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，黃瓜CsCER4與同為葫蘆科的甜瓜(Cucumismelo)、苦瓜(Momordicacharantia)、南瓜(Cucurbitamoschata)、西葫蘆(Cucurbitapepo)的CER4 蛋白親緣關(guān)系較近(圖2)，但目前還沒(méi)有生物學(xué)功能鑒定相關(guān)的報(bào)道。

圖2 CsCER4進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of CsCER4 in cucumber and its homologs

2.3 CsCER4表達(dá)模式分析

qRT-PCR分析結(jié)果表明，CsCER4基因在不同組織部位均有表達(dá)，在子房中CsCER4基因的表達(dá)量極顯著高于其他組織，在果皮、葉片和雄花中的表達(dá)量次之，而在莖中的表達(dá)量最低(P<0.01，圖3)，表明該基因的表達(dá)存在組織特異性。

2.4 CsCER4啟動(dòng)子元件分析

利用啟動(dòng)子在線分析軟件PLANTCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)CsCER4基因的啟動(dòng)子調(diào)控元件進(jìn)行分析。取長(zhǎng)約2 000 bp的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在CsCER4啟動(dòng)子序列中鑒定出31個(gè)啟動(dòng)子元件(表1)，其中，ABRE、P-box、TCA-element 對(duì)脫落酸、赤霉素、水楊酸等激素具有反應(yīng)；TC-rich repeats、MBS、ARE響應(yīng)防御、干旱、厭氧等脅迫；TCT-motif等為光響應(yīng)元件；Unnamed-1和CAAT-box等為啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域中的順式元件。根據(jù)啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果，推測(cè)黃瓜CsCER4基因?qū)に?、逆境脅迫、光等具有響應(yīng)。CsCER4基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果基本與本試驗(yàn)結(jié)果一致，因此推斷CsCER4基因可能與黃瓜表皮蠟質(zhì)合成有關(guān)。

不同大寫(xiě)字母表示CsCER4基因在不同組織中表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)The different letters mean that the expression of CsCER4 gene is significantly different among different tissues(P<0.01)圖3 黃瓜CsCER4 表達(dá)模式分析 Fig.3 Expression analysis of CsCER4 in cucumber

表1 黃瓜CsCER4基因啟動(dòng)子調(diào)控元件的分析Tab.1 Analysis of regulatory elements in the promoter of CsCER4 in cucumber

注：+ 表示CsCER4基因啟動(dòng)子正義鏈中有這個(gè)調(diào)控元件。

Note: + indicates that this regulatory element is present in the sense strand of theCsCER4gene promoter.

3 結(jié)論與討論

大部分陸生植物的氣生器官表面覆蓋一層蠟質(zhì)，蠟質(zhì)幫助植物抵御干旱、紫外線輻射、病原菌侵染等外界環(huán)境脅迫。目前，對(duì)擬南芥的蠟質(zhì)合成途徑及作用機(jī)制進(jìn)行了較多研究，但有關(guān)黃瓜蠟質(zhì)合成及其分子調(diào)控還知之甚少。本研究克隆了擬南芥中蠟質(zhì)合成基因CER4在黃瓜中的同源基因CsCER4。CsCER4含有IPR026055結(jié)構(gòu)域，屬于脂肪?；o酶A還原酶(FAR)家族，其在擬南芥中的同源基因CER4主要參與表皮蠟質(zhì)合成過(guò)程中烷烴形成的初級(jí)醇途徑，因此，推測(cè)CsCER4基因可能也與烷烴形成的初級(jí)醇途徑有關(guān)。CsCER4與同屬中甜瓜CER4的同源性最高，進(jìn)化分析表明，該基因編碼的蛋白質(zhì)與多數(shù)植物親緣關(guān)系符合植物進(jìn)化規(guī)律。

植物蠟質(zhì)一般在植物表皮細(xì)胞中合成，蠟質(zhì)合成基因在表皮中含量最高，本試驗(yàn)qRT-PCR結(jié)果中，CsCER4基因在黃瓜子房中表達(dá)量最多，其次是果皮，可能是由于開(kāi)花之前，黃瓜子房進(jìn)行伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，主要在內(nèi)果皮和果肉中發(fā)生核內(nèi)復(fù)制[31]，因此在子房中表達(dá)量最高。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，CsCER4基因啟動(dòng)子具有啟動(dòng)子常有的相應(yīng)調(diào)控元件以及下游組織特異性表達(dá)必需的核苷酸序列，包括TATA-box、CAAT-box等。NOBUSAWA等[32]認(rèn)為，植物表皮蠟質(zhì)參與植物激素穩(wěn)態(tài)，CsCER4基因啟動(dòng)子序列中ABRE、P-box、TCA-element 對(duì)脫落酸、赤霉素、水楊酸等激素具有響應(yīng)。CsCER4基因啟動(dòng)子序列中還有響應(yīng)防御、干旱、氧氣以及光照的啟動(dòng)子元件。前人研究結(jié)果表明，植物表皮蠟質(zhì)常常受逆境環(huán)境的誘導(dǎo)[33]。在干旱條件下，參與石竹表皮蠟生物合成的3個(gè)基因DsCER1、DsMAH1和DsWSD1表達(dá)量顯著升高[34]。玉米、擬南芥等植物蠟質(zhì)合成中的關(guān)鍵基因在mRNA水平上的表達(dá)受干旱、鹽逆境處理調(diào)節(jié)[35]。在高鹽和干旱處理?xiàng)l件下，水稻OsCER4基因表達(dá)量均有所上調(diào)[36]。CsWax2和CsCER1可以被低溫、干旱、鹽等非生物脅迫誘導(dǎo)，表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)[30]。綜上所述，CsCER4基因可能直接參與或通過(guò)調(diào)控蠟質(zhì)合成途徑影響蠟質(zhì)的合成，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。