土壤中添加生物炭對玉米幼苗紋枯病抗性的影響

郭懷剛，付東波，林俊俊，王智慧，殷大偉，徐晶宇,2,4，李佐同，趙長江

(1.黑龍江八一農墾大學 農學院，黑龍江 大慶163319； 2.黑龍江省現代農業(yè)栽培技術與作物種質改良重點實驗室，黑龍江 大慶163319； 3.黑龍江省秸稈資源化利用工程技術研究中心，黑龍江 大慶163319； 4.黑龍江省普通高校寒地作物種質改良與栽培重點實驗室，黑龍江 大慶163319； 5.黑龍江省八五零農場，黑龍江 虎林 158422)

生物炭是農林有機廢棄物和畜禽糞便等生物質在缺氧情況下，經高溫慢熱解(通常<700 ℃)形成的一類穩(wěn)定、高度芳香化、富含碳素的固態(tài)產物[1]。生物炭具有較高的孔隙度，施入土壤后能夠顯著改善土壤的孔隙結構[2]。另一方面，生物炭含有多種有機元素和礦質元素，可提高土壤的保水能力，同時還能提升土壤肥力，促進作物生長并提高產量[3-4]。此外也有研究發(fā)現，添加秸稈生物炭可以提高草甸黑土中有機碳和有效養(yǎng)分的含量，豐富土壤中的微生物群落，有利于植物生長[5]。研究表明，生物炭可以促進小麥種子萌發(fā)和幼苗生長[6]，改善玉米地上部的生長特征，促進地上部干物質積累，有利于作物養(yǎng)分積累[7-8]。由于生物炭的原材料或制備方式不同等因素，生物炭在農田中的使用效果也不盡相同[9]。此外，施用生物炭具有緩解逆境脅迫的功能。生物炭可作為吸附劑有效吸附環(huán)境中的重金屬離子和有機污染物，減弱其對環(huán)境和生物體的毒害作用[10]。楊曉智等[11]指出，添加生物炭能夠明顯促進Pb2+脅迫下玉米幼苗的生長。王紅等[12]指出，生物炭有助于修復 Zn、Pb 污染的土壤，隨生物炭添加量增加，土壤浸出液中Zn、Pb含量逐漸降低。生物炭因其在改良土壤物理結構和化學結構、豐富土壤微生物、提高作物產量等方面具有重要作用而備受關注，前人關于生物炭改良土壤性質和提高作物產量的研究較多，而且也有研究表明，生物炭可以改變微生物群落的多樣性[13]。但關于生物炭調節(jié)作物抗病性方面的研究報道較少。鑒于此，在玉米上接種紋枯病菌立枯絲核菌株，研究土壤中添加不同量生物炭對玉米幼苗紋枯病抗性及其生理機制的影響，明確生物炭在作物抗性中的作用，為我國糧食作物病害的有機防控及秸稈源生物炭的廣泛利用提供理論和技術參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與設計

試驗于2017—2018年在黑龍江八一農墾大學黑龍江省秸稈資源化利用工程技術研究中心進行。供試土壤為草甸黑鈣土，含有機質21.6 g/kg、堿解氮160.65 mg/kg、速效磷9.74 mg/kg、速效鉀245.6 mg/kg，pH值7.72。生物炭為玉米秸稈炭，購于遼寧金和福農業(yè)開發(fā)有限公司，基本理化性質為pH值7.94，含碳(C)44.06%、氮(N)1.53%、磷(P)0.78%、鉀(K)1.68%。

供試玉米雜交種為鄭單958，立枯絲核菌株AG-1 IA由四川農業(yè)大學鄭愛萍教授提供。挑選飽滿、大小均一、無破損的玉米種子，用10% NaClO消毒15 min，再用無菌水清洗4次，放在28 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)催芽。然后播種于口徑為18 cm的塑料盆中，每盆定植6株。按生物炭占栽培用土總量的百分比不同，試驗設0(B0)、1%(B1)、5%(B5)、9%(B9)4個處理，每個處理30盆。立枯絲核菌在培養(yǎng)箱中28 ℃暗培養(yǎng)4 d用于接種。玉米幼苗培養(yǎng)條件為：晝夜溫度(25±2)℃/(20±2)℃，光照12 h，光強1 000 μmol/(m2·s)，相對濕度60%～80%。長至三葉一心時，采用葉鞘牙簽嵌入法與葉片昆蟲針固定法進行立枯絲核菌菌絲兩點接種，每盆6株均進行接種，接菌部位為第2片葉葉鞘和第2片葉。

1.2 測定項目及方法

接菌0、72 h(分別用R0、R72表示)，每個處理取5盆，每盆取3株，共15株，測定玉米植株株高、根長、地上和地下鮮質量、地上和地下干質量，并參照王學奎[14]的方法測定并計算R0和R72葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和類胡蘿卜素(Car)的含量；同時，每個處理取5盆，每盆取1株，利用Planteye F500(荷蘭)表型儀測得NDVI(歸一化植被指數)圖。接菌0、6、12、24、48、72 h(即R0、R6、R12、R24、R48、R72)取各處理相同質量的鮮樣，采用電導率儀(DDSJ-308F，上海儀電科學儀器股份有限公司)測定質膜相對透性；剩余樣品用錫箔紙包好，投入液氮中速凍，-80 ℃冷藏備用測定生理指標，3次重復。參照JIANG等[15]的方法測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性；參照HODGES等[16]的方法用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量；參照劉明楊等[17]的方法采用蒽酮法測定可溶性糖含量；參照李合生[18]的方法采用考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量；參照王愛國等[19]的方法采用羥胺氧化法測定超氧陰離子產生速率；參照VELIKOVA等[20]的方法測定植株中H2O2含量。

1.3 數據分析

利用Excel 2010對數據進行整理和圖表制作，利用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，采用 Duncan’s檢驗法進行多重比較及差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 土壤中添加生物炭對紋枯病菌侵染玉米幼苗表型的影響

由表1和圖1可見，除根冠比、株高、根長外，土壤中添加生物炭處理玉米幼苗的地上和地下鮮、干質量均高于不添加生物炭處理。接種紋枯病菌0 h，與B0處理相比，3個生物炭添加量處理對玉米表型和質量的影響隨生物炭添加量增加而遞減(根長除外)。其中，B1處理玉米幼苗株高和根長均顯著高于B0處理，而B9處理株高、根長與B0處理差異不顯著。接種紋枯病菌72 h，所有處理均出現明顯病斑，從群體水平看，所有處理都在接種點顯癥，葉片接種處發(fā)生垂折，對照垂折明顯，添加生物炭處理垂折弱些，其中B1處理葉片垂折情況明顯優(yōu)于B0處理，而且圖1也表明，接菌72 h植株的NDVI明顯低于接菌0 h，生物炭處理接菌玉米NDVI高于不添加生物炭處理；從個體水平看，B0處理在2個接種點處發(fā)病均比添加生物炭處理嚴重，且添加生物炭處理間也存在一定差異，B9處理發(fā)病最重。

如表1所示，與接種紋枯病菌0 h相比，接種紋枯病菌72 h，B0、B1、B5、B9處理株高、根長、地上鮮質量、地下鮮質量、地上干質量、地下干質量分別降低13.8%～18.6%、9.3%～40.2%、22.2%～28.3%、20.4%～38.2%、30.8%～43.3%、25.9%～41.2%。說明玉米紋枯病會降低玉米生物量的積累，影響玉米的正常生長。其中B1處理下降幅度除地下干質量外均略小，說明添加1%生物炭對玉米幼苗紋枯病抗性的增強作用較明顯。

表1 土壤中添加生物炭對紋枯病菌侵染玉米幼苗生物量的影響Tab.1 Effect of adding biochar in soil on biomass of maize seedlings infected by Rhizoctonia solani

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant differences(P<0.05),the same below.

A：添加生物炭玉米未接菌； B：添加生物炭玉米接菌72 h； C：添加生物炭玉米未接菌NDVI圖； D：添加生物炭玉米接菌72 h NDVI圖A：Maize with biochar not incuoculated; B：Maize with biochar after being inoculated for 72 h; C:NDVI map of maize with biochar not incuoculated; D：NDVI map of maize with biochar after being inoculated for 72 h圖1 土壤中生物炭不同添加量對玉米生長的影響及接菌72 h的變化Fig.1 Effect of different concentrations of biochar in soil on maize growth and changes after being inoculated for 72 h

2.2 土壤中添加生物炭對紋枯病菌侵染玉米幼苗葉綠素含量及葉綠素熒光參數的影響

由表2可知，與接種紋枯病菌0 h相比，接種紋枯病菌72 h玉米Chla、Chlb、Car含量整體表現為降低，且B0、B1、B5、B9處理分別下降了16.7%、53.6%、54.5%，12.1%、19.9%、12.5%，12.9%、20.0%、33.3%，12.9%、48.0%、45.5%。其中，接種紋枯病菌72 h，B1、B5、B9處理植株內葉綠素含量總體上均高于B0處理，且B1處理Chla含量最高，說明玉米紋枯病使植株內光合色素含量降低，而添加生物炭可以減少植物體內葉綠素的分解。Fv/Fm為PSⅡ的最大光能轉換效率，由表2可知，與接種紋枯病菌0 h相比，接種紋枯病菌72 h玉米幼苗葉片Fv/Fm值均降低，且B0、B1、B5、B9處理分別下降了49.2%、15.9%、20.6%、21.3%。由此可見，立枯絲核菌會導致玉米幼苗PSⅡ的光能最大效率下降，光合效率降低，影響玉米幼苗的生物量積累。

2.3 土壤中添加生物炭對紋枯病菌侵染玉米幼苗MDA含量和相對電導率的影響

如圖2A所示，生物炭不同添加量處理玉米MDA含量隨接菌時間延長呈升高趨勢。接菌72 h，B0、B1、B5、B9較接菌0 h分別升高了101.1%、77.1%、95.3%、119.1%，而且在接菌0～72 h，添加生物炭處理均較B0處理顯著降低，其中B1處理總體表現為最低，這可能與該處理發(fā)病相對較輕有關。如圖2B所示，生物炭不同添加量處理玉米葉片相對電導率隨接菌時間延長呈上升趨勢，接菌72 h B0、B1、B5、B9處理較接菌0 h分別升高了131.9%、106.0%、128.1%、165.7%，說明玉米紋枯病發(fā)生時，細胞膜遭到破壞，膜透性增大，從而使細胞內的電解質外滲，且在B1處理時玉米葉片相對電導率較低。

表2 土壤中添加生物炭對紋枯病菌侵染玉米幼苗葉綠素含量及葉綠素熒光參數的影響Tab.2 Effects of adding biochar in soil on chlorophyll content and chlorophyll fluorescence parameters of maize seedlings infected by Rhizoctonia solani

不同小寫字母表示相同接菌時間不同生物炭添加量處理差異顯著(P<0.05)Different lowercase letters indicate significant differences among treatments with different amount of biochar added at the same time (P<0.05)圖2 土壤中添加生物炭對紋枯病菌侵染玉米幼苗葉片MDA含量及相對電導率的影響Fig.2 Effects of adding biochar in soil on MDA content and relative conductivity of maize seedling leaves infected by Rhizoctonia solani

2.4 土壤中添加生物炭對紋枯病菌侵染玉米幼苗超氧陰離子產生速率和過氧化氫含量的影響

由圖3可見，接菌72 h，所有處理植物體內超氧陰離子產生速率和過氧化氫含量都顯著高于接菌0 h。其中，B0、B1、B5、B9處理超氧陰離子產生速率較接菌0 h分別增加了69.1%、62.0%、65.3%、43.2%；過氧化氫含量較接菌0 h分別增加了53.1%、48.0%、40.6%、30.2%。說明紋枯病菌侵染玉米植株后，打破玉米體內的活性氧(ROS)平衡，導致超氧陰離子自由基含量和過氧化氫含量升高，而添加生物炭可減少膜脂發(fā)生氧化損傷，尤以B1處理效果較好。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05)圖3 土壤中添加生物炭對紋枯病菌侵染玉米幼苗超氧陰離子產生速率和H2O2含量的影響Fig.3 Effects of adding biochar in soil on superoxide anion production rate and H2O2 content in maize seedlings infected by Rhizoctonia solani

2.5 土壤中添加生物炭對紋枯病菌侵染玉米幼苗可溶性蛋白含量和可溶性糖含量的影響

由圖4A所示，各生物炭處理玉米體內可溶性蛋白含量隨接菌時間延長呈上升趨勢，且接菌72 h，B0、B1、B5、B9處理較接菌0 h分別升高了53.0%、52.9%、52.1%、61.3%，說明玉米紋枯病提高了植物體內可溶性蛋白的含量。圖4B為可溶性糖含量，接菌72 h，B0處理較接菌0 h升高了190.9%；B1、B5、B9處理可溶性糖含量隨接菌時間延長呈先降低后上升趨勢，接菌72 h較接菌0 h分別升高了16.5%、70.1%、140.7%。說明玉米紋枯病引起植物體內可溶性糖含量升高，且B1處理升高不顯著(P>0.05)。

圖4 土壤中添加生物炭對紋枯病菌侵染玉米幼苗葉片可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響Fig.4 Effects of adding biochar in soil on soluble protein and soluble sugar content in leaves of maize seedlings infected by Rhizoctonia solani

2.6 土壤中添加生物炭對紋枯病菌侵染玉米幼苗抗氧化酶活性的影響

不同小寫字母表示相同生物炭添加量不同接菌時間差異顯著(P<0.05)，下同Different lowercase letters indicate significant differences among different inoculation time under the same amount of biochar added(P<0.05),the same below圖5 土壤中添加生物炭對紋枯病菌侵染玉米幼苗葉片SOD、POD活性的影響Fig.5 Effects of adding biochar in soil on the activities of SOD and POD in maize seedling leaves infected by Rhizoctonia solani

圖6 土壤中添加生物炭對紋枯病菌侵染玉米幼苗葉片CAT、APX活性的影響Fig.6 Effects of adding biochar in soil on the activities of CAT and APX in maize seedling leaves infected by Rhizoctonia solani

3 結論與討論

添加生物炭可以固炭，提高土壤有機碳和有效養(yǎng)分含量，改變土壤養(yǎng)分結構，增加土壤疏松性，豐富土壤中微生物群落，有利于植物生長[21]。王智慧等[22]研究表明，添加生物炭有利于玉米幼苗株高、莖粗增加。唐春雙等[23]研究表明，玉米鮮質量和干質量在一定程度上隨著生物炭添加量的增加而增加，與本研究中玉米株高、根長、鮮質量、干質量隨生物炭添加量增加呈不同程度增加的結果相同。同時本試驗表明，葉綠素a含量隨著生物炭添加量增加呈現不同程度的升高，這與馬芙蓉[24]指出的玉米葉片葉綠素含量隨著生物炭施用量增加呈緩慢增加趨勢，提高玉米的光合作用能力等結果相吻合。另外，本試驗還得出，玉米紋枯病會降低玉米幼苗生物量的積累，影響玉米的正常生長，而土壤中添加1%生物炭處理玉米幼苗受紋枯病影響略小。

可溶性糖作為植物的碳源和能量來源，對細胞膜結構起穩(wěn)定作用，同時還能維持細胞的滲透平衡，保護多種酶活性。陳轉成[25]研究表明，馬鈴薯接種立枯絲核菌后塊莖可溶性糖與可溶性蛋白含量發(fā)生顯著變化。本研究發(fā)現，當玉米幼苗受到立枯絲核菌菌絲侵染后，植株體內可溶性蛋白含量和可溶性糖含量增加，且在B1處理時升高最小。

李榮花等[26]發(fā)現，玉米接種紋枯菌后SOD活性表現為先增加后降低的趨勢，而POD活性呈逐漸增加趨勢。郭紅蓮等[27]研究表明，玉米受灰斑病菌侵染后SOD、CAT、POD活性變化顯著。本試驗中立枯絲核菌侵染玉米后，植株內SOD活性與上述試驗結果略有不同，B0、B5、B9處理隨接菌時間延長呈先下降后上升再下降的趨勢，B1處理則呈先下降后上升的趨勢，而POD、CAT、APX活性均呈現不同程度的變化?？赡艿脑蚴怯衩子酌缭谑艿搅⒖萁z核菌侵染后，體內產生大量的活性氧，打破原有活性氧平衡，為消除過多的活性氧，植物體內產生大量抗氧化酶，酶活性上升。

同時，紋枯菌侵染玉米植株后，植株發(fā)生膜脂氧化現象，導致MDA含量增加、膜結構破壞，細胞內液外流，這也是導致細胞浸出液電導率上升的直接原因，與立枯絲核菌在水稻方面的研究結果一致[28]。而MDA含量和相對電導率在B1處理時最低，說明膜脂氧化損傷較低，細胞膜完整度相對較高。本研究表明，生物炭不同添加量對玉米紋枯病抗性機制產生不同程度的影響，從而在一定程度內推遲玉米紋枯病發(fā)病時間，且土壤中添加1%生物炭處理對紋枯病的抗性增強最多。