豬精子冷凍保存技術(shù)的研究進(jìn)展

左曉宇，任 尚，吳方超，汝振遠(yuǎn)，張翔棟，焦 俊，張曉東，張運(yùn)海*，曹祖兵*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院地方畜禽遺傳資源保護(hù)與生物育種安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230036；2.安徽省浩宇牧業(yè)有限公司，安徽 六安 237451）

隨著生活水平的不斷提高，人們對于豬肉的需求量越來越大，豬肉在肉類生產(chǎn)中的占比已經(jīng)達(dá)到了37%［1］，生豬產(chǎn)業(yè)也成為我國畜牧業(yè)發(fā)展的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)［2］。受非洲豬瘟疫情的影響，我國的一些地方豬品種面臨滅絕危機(jī)［3］。地方豬品種遺傳資源保護(hù)工作勢在必行，而凍精技術(shù)已成為保種工作中用來保存公豬基因必不可少的一環(huán)［4-5］，因此凍精技術(shù)在保種上有著重要的意義。

眾所周知，豬肉是我國人民必不可少的一種食物，豬肉的生產(chǎn)關(guān)乎我國廣大人民的飲食安全。養(yǎng)豬業(yè)既要防范生物安全危害，又要擴(kuò)大母豬繁育，重視安全的同時(shí)也要擴(kuò)大養(yǎng)豬規(guī)模。為了避免生物危害且能快速擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，利用豬冷凍精液保存技術(shù)結(jié)合低劑量子宮深部輸精和性控精液技術(shù)進(jìn)行引種配種在當(dāng)今的大環(huán)境下顯得尤為重要。

1 豬精液冷凍保存技術(shù)發(fā)展過程

冷凍精液是指在超低溫條件下（液氮、-196℃）使精子代謝停止，從而達(dá)到長期保存的固態(tài)精液［6］。經(jīng)解凍后的精子可以采用人工授精、體外授精技術(shù)進(jìn)行利用。精液冷凍保存的研究已有很長的歷史，早在1787年，意大利科學(xué)家首次嘗試將馬精液放在-17℃雪中進(jìn)行冷凍，在解凍后發(fā)現(xiàn)有少量精子存活［7］。20世紀(jì)30年代首次將蟑螂和哺乳動(dòng)物精液放到乙醇和雪的混合物中并使溫度降到-23℃，結(jié)果顯示，解凍后仍有一些活著的精子［8］。20世紀(jì)40年代英國科學(xué)家polge首次發(fā)現(xiàn)甘油對冷凍精子有保護(hù)作用。此后精子的冷凍保存技術(shù)便迎來了突破，使得精子冷凍技術(shù)取得了巨大的發(fā)展。隨后人們又將液氮冷凍應(yīng)用于凍精［4］。1962年日本人永賴發(fā)明了顆粒凍精，隨后法國卡蘇公司又發(fā)明了凍精細(xì)管，并很快推廣到了全世界。之后研究者在不同動(dòng)物中進(jìn)行精液冷凍保護(hù)試驗(yàn)，均取得了一定的成功。豬精液冷凍在20世紀(jì)70年代已經(jīng)開始，但是利用豬冷凍精液進(jìn)行輸精所占的比例依舊很低，只有不到1%［9］。現(xiàn)今豬冷凍精液技術(shù)主要應(yīng)用于遠(yuǎn)距離跨國引種和珍貴豬種的保種工作。

2 豬精液冷凍保存技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)

2.1 冷凍保護(hù)液與冷凍保護(hù)劑的選擇

常用的豬凍精冷凍保護(hù)液有兩種：以葡萄糖為基礎(chǔ)配制的冷凍保護(hù)液和β-半乳糖為基礎(chǔ)配制的冷凍保護(hù)液。兩者都常以甘油等成分作為冷凍保護(hù)劑，并加入20%卵黃和其他成分。制作凍精時(shí)使用的保護(hù)液有預(yù)稀釋液、冷藏保護(hù)液（Ⅰ液）和冷凍保護(hù)液（Ⅱ液）。豬精液冷凍常使用兩步稀釋法，即在稀釋后的鮮精中依次加入Ⅰ液和Ⅱ液。研究表明，冷凍保護(hù)液中添加不同濃度、不同類型的冷凍保護(hù)劑，凍精質(zhì)量相差很大［10-12］。

常用的冷凍保護(hù)劑有以下幾種：（1）甘油（ply）。甘油是一種無色透明、脂溶性油狀液體，易穿過細(xì)胞膜，能在冷凍精子時(shí)減少精子內(nèi)部冰晶的形成。使用甘油冷凍精子時(shí)需要注意甘油濃度，太低起不到保護(hù)精子的作用，太高會(huì)影響解凍后精子的受精能力、頂體完整性、活率，使精子凍后質(zhì)量變差［13］。此外，研究還發(fā)現(xiàn)豬精子在5%～7%甘油中保存10 h會(huì)降低受胎率［14］，使用甘油作為冷凍保護(hù)劑時(shí)在Ⅱ液中添加的適當(dāng)甘油濃度為3%。除此之外，溫度也是甘油使用時(shí)需要注意的因素。研究證實(shí)，甘油在5℃時(shí)能提高豬精子活力，在15℃時(shí)會(huì)降低豬精子活力［14］。因此，在添加Ⅱ液降溫到4℃后需要控制好溫度，避免升溫影響凍精質(zhì)量。甘油是凍精制作中主流的冷凍保護(hù)劑。研究表明，采用甘油作為冷凍保護(hù)劑制作的凍精，結(jié)合低劑量子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)進(jìn)行輸精，母豬受胎率、產(chǎn)仔數(shù)均達(dá)到了常溫精液水平［9］。（2）二甲基亞砜（DMSO）。DMSO常作為細(xì)胞冷凍的冷凍保護(hù)劑、膜滲透劑進(jìn)行使用［12］，也在凍精中使用。DMSO在魚類凍精中使用獲得了不錯(cuò)的效果，DMSO濃度為10%～20%時(shí)受精率達(dá)到77%［15］。兔精液使用DMSO冷凍復(fù)蘇后精子活力可以達(dá)到60%［16］。有研究者在山羊凍精的冷凍保護(hù)劑中加入不同濃度的DMSO進(jìn)行對比，結(jié)果表明，添加最高濃度（1.75%）的DMSO后，精子凍后復(fù)蘇活力達(dá)到了41.2%［17］。DMSO雖然可以降低精子畸形率，提高頂體、脂膜完整率，但解凍后精子活率有所下降［12］。有研究表明，DMSO對豬精子的毒性很大，在豬凍精中使用DMSO需要慎重［18］。（3）乙二醇（EG）。乙二醇常被用作防凍劑，也被用作冷凍保護(hù)劑。在山羊凍精中有學(xué)者用6%甘油和5%EG作為冷凍保護(hù)劑進(jìn)行對比，結(jié)果表明，EG組比甘油組精子活力提高10%。這是由于EG分子比甘油分子小，滲透性能高于甘油［19-20］。據(jù)報(bào)道，在綿羊凍精中添加EG，結(jié)果表明，EG終濃度為5%時(shí)效果最好［21］。在牛凍精中添加7%EG精液冷凍效果最好［22］。研究表明，在豬凍精生產(chǎn)中EG的冷凍保護(hù)效果優(yōu)于其他類型冷凍保護(hù)劑［18］。因此作為一種新型的冷凍保護(hù)劑，未來EG在豬凍精生產(chǎn)中將會(huì)擁有不可替代的作用。（4）丙二醇（PG）。丙二醇也具有一定的冷凍保護(hù)作用，其滲透能力弱于EG，高于甘油［23］。有學(xué)者使用大黃魚的精液測試PG的冷凍保護(hù)效果，結(jié)果表明，PG的冷凍保護(hù)效果不如甘油、DMSO、EG［24］。也有學(xué)者使用兔精液進(jìn)行測試，得出了類似的結(jié)果［25］。因此，推測豬冷凍精液中PG冷凍保護(hù)效果不如甘油、EG。（5）N-N-二甲基乙酰胺（DMA）。DMA也可作為凍精的冷凍保護(hù)液使用。研究表明，在雞精液冷凍過程中添加DMA的最適濃度是10%，但是其冷凍后精子活力只有甘油組的一半［10］，當(dāng)使用10%DMA與6%甘油混合使用時(shí)，其凍后精子活力高于單獨(dú)使用甘油［10］，但目前DMA在豬凍精中使用較少。

2.2 冷凍方法

冷凍精液方法有兩種，一種是慢速冷凍（緩慢降溫后熏蒸冷凍或程序化冷凍），另一種是玻璃化冷凍（快速冷凍）。慢速冷凍主要是將精子置于含有保護(hù)劑的溶液中，利用程序化冷凍儀產(chǎn)生的液氮冷氣進(jìn)行冷凍。玻璃化冷凍則是使用高濃度冷凍保護(hù)劑與精子混合后直接放進(jìn)液氮進(jìn)行冷凍。在某些物種中玻璃化冷凍精子的凍后效果較好，因?yàn)槔鋮s速率足夠快而減少了精子的冰晶損傷［26-29］。有報(bào)道稱，海藻糖和蔗糖玻璃化冷凍精子活力為30%［28］，但是這與凍精實(shí)際使用所要求的活力相差甚遠(yuǎn)。在各種動(dòng)物精子中豬精子對冷凍保護(hù)劑毒性、滲透壓、活性氧、低溫的變化更加敏感。原因與豬精子質(zhì)膜成分有關(guān)，豬精子質(zhì)膜上膽固醇與磷脂、蛋白質(zhì)與磷脂的比例分別為0.26和1.26，這讓豬的精子質(zhì)膜的穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致其抵抗低溫的能力下降［30-32］。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中一般都借助于程序化冷凍儀的慢速冷凍（程序化冷凍）方法進(jìn)行豬精液的冷凍。

程序化冷凍步驟：將采集的新鮮精液進(jìn)行質(zhì)量檢測，品質(zhì)合格的精液與凍精預(yù)稀釋液1∶1混合，置于室溫（25℃）下平衡1～2 h，隨后把平衡好的精液放入裝有常溫水的泡沫盒中水浴降溫2 h至17℃。將降溫好的精液放到大容量離心機(jī)，800×g離心12～20 min。離心好的精液去除上清液，加入Ⅰ液，加入Ⅰ液的量（mL）=［總精子數(shù)（億）×活力÷目標(biāo)密度（億/mL）］÷2；總精子數(shù)=精液密度（億/mL）×精液體積。加入Ⅰ液后放入4℃冰箱中水浴降溫2.5～3.0 h。降溫完成的精液在4℃環(huán)境中加入同為4℃的Ⅱ液。用噴碼罐裝一體機(jī)在4℃進(jìn)行罐裝之后用程序冷凍儀進(jìn)行冷凍，冷凍程序：4～-5℃100 s；-5～-80℃113 s；-80～-150℃70 s［33］。需要注意的是在冷凍完成后冷凍儀應(yīng)啟動(dòng)加熱程序除霜。冷凍好的凍精裝入拇指管，再裝入束口布袋中，置于放入液氮罐中儲(chǔ)存。

2.3 解凍方法

用長鑷子從液氮中夾出凍精麥管，迅速放入水浴鍋中，麥管放入水浴鍋的同時(shí)用事先準(zhǔn)備好的計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)，同時(shí)鑷子夾住麥管在水浴鍋中不?；蝿?dòng)，待計(jì)時(shí)結(jié)束迅速取出麥管，并用事先準(zhǔn)備好的吸水紙快速擦干。擦干后將凍精封口端剪開，之后使用麥管推針從棉塞端將解凍后的凍精推入到事先準(zhǔn)備好的稀釋液中（稀釋液應(yīng)提前放入37℃水浴鍋中預(yù)熱）。凍精推入稀釋液后應(yīng)輕輕搖勻，之后放到37℃水浴鍋中平衡5～10 min。平衡好的凍精置于精子分析儀中檢測，并做好記錄。注意0.25 mL的麥管在50℃水浴鍋中解凍7～8 s，0.5 mL的麥管在50℃解凍10～15 s。解凍方法不只有50℃這一種方法，還有接近體溫的解凍方法。有學(xué)者分別用38.5，39.0，39.5，40.0℃，每組時(shí)間分為10，20，30 s解凍精子，發(fā)現(xiàn)冷凍后精子在39.5℃條件下解凍30 s的活力最高［34］。在豬冷凍精子解凍過程中，有學(xué)者分別在38℃20 s，42℃20 s，50℃15 s，62℃5 s解凍精子，結(jié)果表明，38℃20 s解凍效果最好，其次是62℃5 s［35］。也有研究表明，豬凍精在50～60℃中解凍效果最好［36］。這可能是由于較高溫度解凍時(shí)精子能快速通過危險(xiǎn)區(qū)［37］。解凍時(shí)應(yīng)當(dāng)特別注意的是解凍時(shí)間要準(zhǔn)確，尤其是在采用較高溫度進(jìn)行解凍時(shí)，要求技術(shù)人員對時(shí)間的把控要非常精準(zhǔn)。

2.4 凍精生產(chǎn)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的優(yōu)化

在豬凍精生產(chǎn)過程中，還可以通過保護(hù)劑成分的改良和精子篩選等手段提高豬凍精質(zhì)量。

（1）使用雙糖配制冷凍保護(hù)液：在實(shí)際生產(chǎn)中配制冷凍保護(hù)劑時(shí)往往使用雙糖而不是多糖，因?yàn)橛醒芯孔C實(shí)雙糖的冷凍保護(hù)效果要優(yōu)于多糖［38-39］。（2）注意精液的質(zhì)量檢測：選用鮮精時(shí)要注意鮮精氣味、色澤、活力等指標(biāo)。（3）分離死精。精液中的死精也應(yīng)當(dāng)引起重視，已有研究證實(shí)精液中的死精會(huì)釋放活性氧（ROS），從而導(dǎo)致凍后精液質(zhì)量變差［40-41］。因此，分離死精理論上可以提高凍精質(zhì)量。分離死精常使用密度梯度離心法［42］或上游法［43］，也可利用磁力選擇來分離死精和選擇精子［44-46］。（4）水分子磁力修飾。有學(xué)者為了減少精子冷凍過程中冰晶的形成，嘗試對水分子進(jìn)行磁力修飾來改變水的分子結(jié)構(gòu)，從而改變水的結(jié)晶溫度，這使精子的凍后活力得到提高［47］。（5）減少冷凍過程中精子的死亡。有些科研人員對離心過程進(jìn)行優(yōu)化，在精子離心瓶中添加碘化鉀氣墊來減少離心對精子產(chǎn)生的沖擊，這種方法能使精子凍后活率上升0.5%［48］。（6）添加利于抗凍的成分。例如添加褪黑素、白藜蘆醇、紅景天多糖、多組氨酸新型細(xì)胞凋亡抑制劑、植物提取物、精漿、膽固醇均會(huì)提高精子的凍后活力、精子頂體和質(zhì)膜完整性［48-51］。（7）其他。有學(xué)者利用高壓均質(zhì)的方法生產(chǎn)卵黃粉［52］，它可有效減少卵黃中的雜質(zhì)，此種方法可能提升了精子凍后質(zhì)量。生產(chǎn)的卵黃粉可以省去技術(shù)人員配制凍精試劑過程中剝雞蛋的步驟，只需取卵黃粉進(jìn)行溶解，方便一線人員配制冷凍保護(hù)液。納米技術(shù)同樣也值得關(guān)注［53］。已有學(xué)者利用納米技術(shù)進(jìn)行精子冷凍試驗(yàn)［54-55］，雖然試驗(yàn)結(jié)果不盡人意，但是這些新方法值得深入研究、完善，相信在未來隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新方法將會(huì)應(yīng)用到豬凍精生產(chǎn)上來，屆時(shí)豬凍精技術(shù)將會(huì)越來越完善，凍精質(zhì)量會(huì)越來越高。

3 豬冷凍精子的應(yīng)用

3.1 精子受精的基本原理

精子在向受精部位運(yùn)動(dòng)的過程中會(huì)出現(xiàn)阻礙精子前進(jìn)的因素，只有了解這些因素才能有效實(shí)施低劑量子宮內(nèi)深部輸精。阻礙精子到達(dá)受精部位的主要原因是以下兩點(diǎn)：（1）重力作用造成精子回流。一般采用普通輸精方法25%～45%的精子會(huì)回流浪費(fèi)［56-57］。（2）母體對精子進(jìn)行選擇。這種選擇包括非特異性選擇和特異性兩種。非特異選擇過程主要出現(xiàn)在受精后0～15 min，特異性選擇會(huì)在之后的45 min內(nèi)選擇活力較強(qiáng)的精子進(jìn)行受精［46］。在精子到達(dá)輸卵管峽部之前，會(huì)受到子宮頸褶皺及輸卵管絨毛的物理阻礙，從而丟失了一部分精子。采用普通方法進(jìn)行人工授精大概會(huì)消耗80～100 mL含有15億～40億個(gè)精子的精液［58］。國外曾有學(xué)者對自然交配和普通人工授精到達(dá)子宮與輸卵管交界處、輸卵管峽部的精子數(shù)做過統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，到達(dá)子宮輸卵管交界處的精子為（1～3）×105個(gè)，而到達(dá)輸卵管峽部的精子僅為（1～3）×103個(gè)［59］。大部分精子在到達(dá)受精部位之前都被淘汰了，這是一種極大的浪費(fèi)。有研究者指出，采用低劑量精液進(jìn)行子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)可以減少50%的回流精液量［60］，所需的精子數(shù)更少。精液冷凍是一種用于保存具有高遺傳力和優(yōu)良性狀種公豬遺傳信息的方法，利用低劑量精子進(jìn)行子宮內(nèi)深部輸精就顯得尤為重要。

3.2 豬冷凍精液低劑量深部輸精

20世紀(jì)50年代，英國瑞丁人工授精中心做的關(guān)于牛凍精的人工授精試驗(yàn)中，首次將人工授精技術(shù)與精液冷凍保存技術(shù)結(jié)合應(yīng)用。在此之后經(jīng)過了70年的發(fā)展，使用豬凍精進(jìn)行人工授精占人工授精的比例仍很小，只有1%左右［30］。其原因是大多數(shù)凍精解凍后活力只有50%～60%，其活力遠(yuǎn)低于鮮精［61-62］。隨著人工授精技術(shù)的發(fā)展，尤其是低劑量子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)的發(fā)展，冷凍精液的授精成功率得到了相應(yīng)的改善［62-63］。采用低劑量子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)，僅使用較少的輸精劑量就可以實(shí)現(xiàn)與普通人工受精同樣的授精效果；能使精子直接深入子宮角、子宮體、子宮與輸卵管交界處，避免母體陰道、子宮頸等部位對精子的選擇作用，使更多的精子能到達(dá)受精部位。因此，采用低劑量子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)時(shí)使用少量的精子便可使同樣數(shù)量的卵母細(xì)胞受精，保證了產(chǎn)仔率。也因此，低劑量深部輸精技術(shù)對于較為珍貴的凍精使用就顯得非常重要。尤其是非洲豬瘟在我國流行的大背景下，活體引種已不再安全，使用低劑量精子進(jìn)行子宮內(nèi)深部輸精，成為了一個(gè)很好的選擇。凍精低劑量子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)能夠做到安全引種，降低生物安全風(fēng)險(xiǎn)，并兼顧繁殖效益?，F(xiàn)今的輸精方式正在朝著減少一次輸精的精子數(shù)量、體積，以期獲得更好的經(jīng)濟(jì)效益的方向發(fā)展。這使得深部輸精技術(shù)越來越受到歡迎。深部輸精相比較于傳統(tǒng)的輸精方式對精子的利用率顯著提升［64-65］。普通人工授精一個(gè)授精劑量需要精子約30億個(gè)，應(yīng)用于凍精輸精中是一種極大的浪費(fèi)。有研究者采用低劑量子宮內(nèi)深部輸精輸卵管微創(chuàng)手術(shù)的方法進(jìn)行輸精，把每條輸精管所需要的有效精子數(shù)減少到了3×105個(gè)［66］。相信在未來隨著子宮內(nèi)深部輸精技術(shù)的完善每次輸精所需要精子數(shù)量會(huì)越來越少，深部輸精與凍精技術(shù)的結(jié)合會(huì)大大方便遠(yuǎn)距離跨地域的引種工作、稀有豬種保種工作。

根據(jù)輸入精液部位不同，低劑量子宮內(nèi)深部輸精可分為輸卵管輸精法（intra-oviductal insemination，IOI）、子宮角輸精法（deep uterine insemination，DUI）和子宮頸后人工輸精法（post-cenrical insemination，PCI）。PCI法又稱子宮體（宮腔）輸精法（intrauterine insemination，IUI）。IOI主要指借助腹腔鏡設(shè)備，并采用微創(chuàng)手術(shù)的方法，將精液直接輸送到子宮輸卵管結(jié)合部位，其輸精數(shù)較少，只需要3萬～6萬個(gè)精子即可滿足授精需要。DUI主要利用長1.8 m的輸精管將精液輸送到子宮角處，一次授精所需要的鮮精精子數(shù)與普通人工授精方式相比，將減少至原來的5.0%，需要100萬～200萬個(gè)精子；利用凍精進(jìn)行人工授精，所需凍精精子數(shù)減少至原來普通人工授精的16.7%。PCI指利用輸精工具使精液穿越母豬子宮頸直接到達(dá)子宮頸后15～20 cm處子宮腔內(nèi)，其一次授精需要10億個(gè)精子左右。目前，IOI由于操作復(fù)雜主要應(yīng)用于科研，而PCI在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用最為廣泛。但是當(dāng)使用比較珍貴的精液進(jìn)行輸精時(shí)IOI、IUI能夠有效減少一次授精所需要的精子數(shù)，這時(shí)使用IOI、IUI進(jìn)行人工授精是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。

實(shí)際生產(chǎn)中常通過以下方式提高人工授精的效率：（1）在精液中添加相應(yīng)成分提高人工授精效率。有研究人員指出，精清可以減少子宮對精液的免疫，從而增加人工授精效率。研究者向精液中添加咖啡因、利鈉肽前體等來提高精子活力，從而提高人工授精效率。（2）加強(qiáng)人工授精技術(shù)人員的培訓(xùn)。配種技術(shù)人員將輸精管準(zhǔn)確插入母豬子宮頸深處能有效提高授精成功率，而初產(chǎn)母豬的深部輸精對技術(shù)要求更高。有研究人員做過統(tǒng)計(jì)，輸精管穿過初產(chǎn)母豬子宮頸的成功率只有86%［67］，遠(yuǎn)低于經(jīng)產(chǎn)母豬成功率（95%）［68］。隨著操作人員熟練度的提升，人工授精成功率也會(huì)有相應(yīng)的提高。（3）授精次數(shù)和時(shí)間的優(yōu)化。母豬不同個(gè)體的持續(xù)發(fā)情時(shí)間是不一樣的，一般是1～4 d；發(fā)情后開始排卵的時(shí)間也不相同，一般在24～36 h之間［69］。授精時(shí)間和排卵時(shí)間之間存在著較強(qiáng)的相關(guān)性，排卵時(shí)間與授精時(shí)間間隔0～24 h內(nèi)進(jìn)行授精的成功率是最高的。有的飼養(yǎng)人員喜歡采取兩次授精的方法，即檢測到發(fā)情后立即進(jìn)行第一次授精，6～12 h后進(jìn)行第二次授精［70］，這種方法相比較于一次授精更為可靠。

4 豬性控精液的冷凍保存

4.1 性控精液概念與現(xiàn)狀

隨著精液冷凍保存技術(shù)和低劑量深部輸精技術(shù)的逐漸成熟，為豬性控精液的冷凍保存及其應(yīng)用提供了技術(shù)支持。性控精液是采用一定的人工手段篩選出X或Y精子，用于繁殖特定性別后代的一項(xiàng)技術(shù)。1991年世界上第一頭利用流式細(xì)胞術(shù)篩選性控精液授精的豬出生，距今已有20多年的歷史［71］。直到現(xiàn)在性控精液的生產(chǎn)依舊依賴于流式細(xì)胞術(shù)［72］。但利用流式細(xì)胞術(shù)分選精子價(jià)格昂貴，并不適用于中小型養(yǎng)豬企業(yè)［73］。據(jù)報(bào)道，豬精子對環(huán)境變化非常敏感，在經(jīng)過流式細(xì)胞儀分選的過程中，染色和熒光照射的過程會(huì)對豬精子造成損傷［74］。

綜上所述，豬的性控精液技術(shù)真正應(yīng)用于生產(chǎn)尚需時(shí)日。眾所周知，性控精液的應(yīng)用離不開精子的超低溫冷凍保存技術(shù)，這是由于分選精子所需的時(shí)間較長，分選場所往往距離輸精地點(diǎn)又比較遠(yuǎn)，分選后精子往往需要冷凍保存。

4.2 性控精液的應(yīng)用

性控精液在奶牛的生產(chǎn)中已經(jīng)廣泛應(yīng)用，但是在養(yǎng)豬業(yè)中并不多見。一方面是由于利用流式細(xì)胞術(shù)等方法分選出豬一次授精劑量的精液成本較高，難以推廣；另一方面養(yǎng)豬業(yè)從業(yè)者還未普遍認(rèn)識到性控精液所帶來的長效收益。應(yīng)用性控精液能夠加快遺傳改良進(jìn)程并能預(yù)選雌性家畜，因此性控精液的應(yīng)用將給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大收益。目前隨著深部輸精技術(shù)的發(fā)展，尤其輸卵管輸精技術(shù)的成熟，每次授精所需的精液量已經(jīng)大大減少，每條輸卵管只需要3×105個(gè)有效精子［71］。相信性控精液技術(shù)與豬子宮深部輸精技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用將成為養(yǎng)豬業(yè)的熱點(diǎn)，豬性控精液的商業(yè)化應(yīng)用也會(huì)在不久的將來得到實(shí)現(xiàn)。

5 展望

隨著越來越多冷凍保護(hù)劑被發(fā)現(xiàn)、分離死精技術(shù)的完善、抗氧化物質(zhì)的添加等新技術(shù)的應(yīng)用，豬凍精制作技術(shù)在逐漸成熟，凍精的質(zhì)量也將逐步提高。凍精的制作成本會(huì)更加低廉，冷凍精液的質(zhì)量必將進(jìn)一步提升，結(jié)合豬人工授精技術(shù)的發(fā)展尤其豬深部輸精技術(shù)的發(fā)展和完善，未來引種和保種工作中使用凍精將成為常態(tài)。未來豬冷凍精液的應(yīng)用前景必定更加廣泛。豬性控精液、豬冷凍精液和人工授精技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用將會(huì)在未來大型種公豬站中實(shí)現(xiàn)常態(tài)化，企業(yè)可以根據(jù)客戶的要求定制不同性別的精液，并實(shí)現(xiàn)全國性長距離的服務(wù)，幫助養(yǎng)豬企業(yè)獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益。