SPE-UPLC測(cè)定火鍋底料中9種合成色素*

王 珂，任 釗，杜 瑞，董建民，劉紅偉

(河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450002)

火鍋因其風(fēng)味獨(dú)特，食用方便及其食材眾多，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)?；疱伒琢献鳛榛疱伒幕A(chǔ)，對(duì)火鍋口感及質(zhì)量有著至關(guān)重要的影響[1]。為了使火鍋底料色彩鮮艷，增加消費(fèi)者食欲，部分餐飲企業(yè)會(huì)在火鍋底料生產(chǎn)過(guò)程中，添加人工合成著色素[2]。人工合成著色素是以苯、甲苯、萘等化工原料經(jīng)過(guò)一系列有機(jī)反合成為含有偶氮鍵苯環(huán)或氧雜蒽結(jié)構(gòu)化合物，其性能穩(wěn)定、色彩鮮艷、成本低廉；含有一定毒性，人體造成傷害[3-5]。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)人工合成著色劑使用范圍和要求都做了嚴(yán)格的規(guī)定[6]，其中人工合成著色劑禁止在火鍋底料中使用。

目前，食品中合成色素的檢測(cè)方法主要方法是高效液相色譜[7-12]?；疱伒琢匣|(zhì)復(fù)雜，油脂含量高，若采用國(guó)標(biāo)GB5009.35-2016方法進(jìn)行前處理，需要先出去油脂，然后在進(jìn)行聚酰胺吸附或液液萃取提(赤蘚紅)取色素；但前處理步驟繁瑣，需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的吸附-解析或液液萃取過(guò)程，會(huì)造成提取不徹底，回收率偏低，結(jié)果不準(zhǔn)確，重復(fù)性差[13]。本文采用固相萃取小柱進(jìn)行樣品凈化，超高效液相色譜進(jìn)行定量分析?？赏瑫r(shí)測(cè)定火鍋底料中檸檬黃、日落黃、新紅、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、赤蘚紅、酸性紅、亮藍(lán)等9種合成色素含量的檢測(cè)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

1290Ⅱ超高效液相色譜(配有二極管陣列檢測(cè)器)，安捷倫科技公司；ProElut PWA-2 SPE柱(150 mg/6 mL)，迪馬科技公司；CR22N/CR21N高速冷凍離心機(jī)，日立集團(tuán)。

檸檬黃(98%，1ST2420)、胭脂紅(98%，1ST2416)、日落黃(98%，1ST2421)、誘惑紅(98%，1ST2412)、新紅(98%，1ST2413)、莧菜紅(98%，1ST2417)、赤蘚紅(98%，1ST2415)、酸性紅(98%，1ST2414)、亮藍(lán)(98%，1ST2422)，均為分析標(biāo)準(zhǔn)品，天津阿爾塔科技有限公司；甲醇、乙腈、乙醇，均為色譜級(jí)，北京迪馬科技公司；甲酸、乙酸、乙酸銨，均為分析純，阿拉丁試劑(中國(guó))；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液、提取液配制

準(zhǔn)確稱取檸檬黃、日落黃、莧菜紅、誘惑紅、新紅、胭脂紅、赤蘚紅、酸性紅、亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品各25 mg(精確至0.1 mg)，用純水定容至25.00 mL，配成1 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備溶液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用純水定容至10 mL，得到1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液溶液。

提取液：移取乙醇80 mL，乙腈80 mL，水60 mL，氨水10 mL，混勻。

1.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm×1.8 μm)；柱溫35 ℃；

流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.02 mol/L的乙酸銨溶液(pH值為6.8)；流速為0.4 mL/min，測(cè)定波長(zhǎng)為254 nm；掃描范圍200～600 nm；進(jìn)樣體積為2.0 μL。梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件

1.4 前處理

稱取2.0 g(精確至0.001 g)樣品于50 mL離心管中，加入提取溶劑15 mL，渦旋震蕩10 min，8000 r/min離心10 min，收集上清液；下層殘留物用15 mL提取液按照上一步驟重復(fù)提取1次。合并2次上清液，在40 ℃水浴條件下，減壓蒸餾至3 mL左右，加入甲酸3 mL待凈化。

ProElut PWA-2小柱使用前依次用5 mL甲醇，5 mL 10%甲酸水活化；將全部待凈化液上樣至小柱，利用重力作用使液體自然流出，棄去流出液。依次用5 mL 10%甲酸水、5 mL甲醇淋洗小柱，并用洗耳球吹干。最后用6 mL氨水-甲醇(15+85)洗脫，收集洗脫液。洗脫液于50 ℃下氮?dú)獯蹈?，加?.00初始流動(dòng)相渦旋均勻后，過(guò)0.22 μm PTFE-Q濾膜上機(jī)。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜圖

圖1 9 種色素液相色譜圖

通過(guò)對(duì)液相條件優(yōu)化，選擇最佳色譜條件，9種合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，樣品加標(biāo)色譜圖以及樣品色譜圖如圖1所示。

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 提取試劑選擇

火鍋底料在生產(chǎn)過(guò)程中，會(huì)加入大量的動(dòng)植物油脂，而檸檬黃、日落黃、新紅等人工合成著色劑易溶于水，難溶于乙醇，不溶于油脂。采用純水做提取溶劑，由于樣品基質(zhì)含有大量動(dòng)植物油脂，部分被吸附在樣品基質(zhì)中色著色劑不能被提取出來(lái)，影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)采用乙醇-乙腈-水體系作為提取溶劑，可以提高合成色素提取率，降低脂溶性成分對(duì)提取色素的干擾。在提取溶液中加入少量的氨水，可以增加色素在提取溶液中溶解度，增強(qiáng)提取效率。

2.2.2 淋洗液優(yōu)化

在固相萃取淋洗過(guò)程中，分別對(duì)比5 mL 10%甲酸水+5 mL甲醇(A)和5 mL水+5 mL甲醇(B)兩種淋洗液對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：除亮藍(lán)外檸檬黃、日落黃、新紅等8種合成色素在A/B兩種淋洗體系外，無(wú)明顯差別。亮藍(lán)在A淋洗體系下回收率比B體系下回收率高15%～20%左右?？赡苁怯捎冢毫了{(lán)易溶于水，在酸性環(huán)境下，亮藍(lán)中的磺酸基團(tuán)或羥基與小柱填料形成氫鍵并牢牢結(jié)合，而A淋洗體系中含有10%甲酸，B體系不含有。

2.2.3 濾膜、復(fù)溶液選擇

圖2 9種色素在不同過(guò)濾器/復(fù)溶液回收率

圖3 9種色素在不同過(guò)濾器中的色譜圖

分別考察了PES、Nylon、PTFE-Q三種材質(zhì)過(guò)濾器；流動(dòng)相(水相)、甲醇、50%流動(dòng)相作為復(fù)溶液。9種色素在不同過(guò)濾器中的回收率及色譜圖如圖2、圖3所示。

由圖2可以看出：選用不同過(guò)濾器，采用不同復(fù)溶液定容，9種色素回收率差別很大。采用PTFE-Q過(guò)濾器，50%流動(dòng)相復(fù)溶，回收率最高，9種回收率均在90%以上；但在此條件下(圖3F)，由于液相色譜溶劑效應(yīng)影響，檸檬黃和新紅峰響應(yīng)值低，峰寬特別大。圖3顯示了9種色素在不同體系下的色譜圖。其中檸檬黃和新紅用流動(dòng)相定容，響應(yīng)值最高；采用甲醇定溶響應(yīng)值最低；采用50%流動(dòng)相定容，峰寬特別大，但響應(yīng)值低。綜合回收率以及色譜響應(yīng)值等因素，選用流動(dòng)相(水相)作為復(fù)溶液。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，選用PES作為過(guò)濾器，過(guò)濾之后濾器上會(huì)吸附很多紅色素，而PTFE-Q過(guò)濾器則沒(méi)有，對(duì)照?qǐng)D2回收率圖，過(guò)濾器殘留的紅色素為赤蘚紅。因此，綜上所述采用PTFE-Q過(guò)濾器，流動(dòng)相作為復(fù)溶液。

2.3 線性回歸和檢出限

對(duì)9種合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定采用峰面積定量，以峰面積對(duì)合成著色劑濃度(μg/mL)求得線性回歸方程。以基線3倍噪音(S/N=3)考察了9種合成著色劑的檢出限。線性范圍在1～50 μg/mL范圍內(nèi)，線性范圍良好，滿足檢測(cè)需要。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 9種著色劑線性方程、保留時(shí)間、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.4 回收率和重復(fù)性

按照GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》要求，選擇某品牌牛油麻辣火鍋底料進(jìn)行3個(gè)不同添加水平加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)水平為：2 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)6次。結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明；方法回收率在82%～99%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.1%～3%之間，滿足實(shí)驗(yàn)需求。

表3 9 種著色劑的回收率結(jié)果(n=6)

3 結(jié) 論

試驗(yàn)研究建立了固相萃取-超高液相色譜法測(cè)定火鍋底料中9種合成著色劑的分析方法。該方法。該方法前處理簡(jiǎn)單快捷，回收率高，精密度好，能夠有效的減少了樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的干擾等優(yōu)點(diǎn)。可用于火鍋底料中人為添加合成著色劑的檢測(cè)，以對(duì)其質(zhì)量及安全進(jìn)行有效控制。