鼻用蒼芷溫敏凝膠的制備工藝*

張 璐，鄭東華

(包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

目前中醫(yī)對鼻淵的治法分為內(nèi)治法和外治法，與內(nèi)治法相比，外治法可以直達病灶，發(fā)揮作用特別快的特點。鼻黏膜下血管非常豐富，且黏膜極薄，藥物可迅速經(jīng)鼻黏膜吸收，避免首過作用，提高生物利用度[1-2]。反相原位凝膠是一種新型熱門的劑型，與傳統(tǒng)的劑型相比，它到達體內(nèi)后，隨著溫度升高，制劑發(fā)生相變，變?yōu)槟z態(tài)，這樣長時間有效滯留于給藥部位，提高生物利用度；而且它也可以制成滴劑或噴霧劑，增加患者的順應(yīng)性，方便給藥，所以劑型改良變得尤為重要[3]?！稘健分刑岬缴n芷復(fù)方為清涼解表藥，是治療鼻炎的良藥。白芷中最重要的成分為香豆素，歐前胡素，其水煎液對大部分桿菌以及少部分其它菌種有強烈的抵抗作用[7]；其中的呋喃香豆精與某些激素(腎上腺素、ACTH)合用可阻礙糖合成脂；提取液大部分可以在脂溶性部位發(fā)揮出消炎止痛兼退熱等功效。蒼耳子中最重要的有效成分為綠原酸，其煎劑對大部分球菌有強烈的抵抗作用[9]，對呼吸、血壓及心臟顯示一定作用。泊洛沙姆無刺激過敏性，不溶血，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，并具有良好的生物相容性。本文改變蒼芷復(fù)方原有的湯劑劑型，用泊洛沙姆做成凝膠制劑[4]。目前，溫敏凝膠常用的材料主要有纖維素、聚丙烯酸類、殼聚糖、聚肽類等. 該實驗采用泊洛沙姆，泊洛沙姆(poloxamer)是聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)組成的嵌段共聚物。泊洛沙姆副作用較小，是常采用的溫敏凝膠材料。鼻腔給藥系統(tǒng)對比于其它給藥方式是一種具有很多優(yōu)勢的制劑，具體可以表現(xiàn)在，能提高身體對藥物的利用程度，提高藥物向腦內(nèi)傳遞的速度，在此基礎(chǔ)上它對比與其它藥劑具有明顯的治療腦部疾病的效果。該藥物在鼻腔內(nèi)使用，其作用機制是經(jīng)鼻腔內(nèi)鼻黏膜吸收，進而可以在局部發(fā)揮藥效或者擴散至全身發(fā)揮治療作用，該藥可以避免首關(guān)效應(yīng)[5]。原位凝膠是一種使用非常方便的制劑，在室溫下為液態(tài)，當(dāng)進入人的鼻腔內(nèi)后形態(tài)會發(fā)生轉(zhuǎn)變，由液態(tài)轉(zhuǎn)為固態(tài)，該藥劑會因環(huán)境的改變而改變。目前研究較為深入的主要有溫度敏感、離子敏感和pH敏感3種類型，且以溫度敏感原位凝膠的研究最為廣泛和成熟[6]。本文擬采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法進行制劑的制備處方優(yōu)化，將原方制成中藥鼻用原位凝膠，也可直接作為一種載體在體內(nèi)藥物傳遞中發(fā)揮重要的作用。這為中藥藥物如何進一步提高治療效果帶入了新的科研方向，這樣可以以制造出具有更好的緩釋性、穩(wěn)定性及靶向性等特點的藥物為目的來進行科學(xué)研究。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀 器

ZF-1紫外分析儀，杭州齊威有限責(zé)任有限公司；TD5002C電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；DZKW電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；Thermo Ultimate3000高效液相色譜儀，(美國)賽默飛世爾科技有限公司；GenPure UV-TOC/UF超純水機，(美國)賽默飛世爾科技有限公司；BSA224S-CW萬分之一電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；ODS 5 μm色譜柱(Hypersil)，依利特。

1.1.2 試 劑

泊洛沙姆407(170301SHXT)，上海厚誠精細(xì)化工有限公司；泊洛沙姆188(2017041302)，上海厚誠精細(xì)化工有限公司；炒蒼耳子(2017041302)，內(nèi)蒙古啟明中藥飲片有限責(zé)任公司；白芷(1609270)，內(nèi)蒙古啟明中藥飲片有限責(zé)任公司；綠原酸98%(SC8210)，北京索萊寶科技有限公司；歐前胡素(SI8030)，北京索萊寶科技有限公司；甲醇(色譜純，016953)，MREDA。

1.2 實驗方法

1.2.1 制 備

白芷、蒼耳子采用溶劑提取法，將白芷(蒼耳子)藥材粉碎后包入紙內(nèi)，索氏提取，80%乙醇溶液為提取液，提取時間2 h，蒸發(fā)濃縮至干即得提取物。

采用冷溶法制備原位凝膠。以一定量的泊洛沙姆407(P407)和泊洛沙姆188(P188)作為凝膠基質(zhì)，取適量上述提取物，加入適量蒸餾水，攪拌混勻，4 ℃冰箱放置過夜，即可得到含藥凝膠。

1.2.2 測試方法

采用傾斜西林瓶法測定凝膠相變溫度。將空白凝膠置于西林瓶中，水浴條件下，將溫度計插入凝膠溶液中，以每分鐘升高0.5 ℃的速率緩慢升高溫度，每隔10 s傾斜西林瓶60°，以凝膠溶液不流動時的溫度為相變溫度。

1.2.3 星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化蒼芷溫敏凝膠處方

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果可知，P407和 P188的質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響蒼芷溫敏凝膠的相變溫度，并且當(dāng)P188的濃度一定時，隨著P407濃度增加，相變溫度降低。當(dāng)P407濃度一定時，隨著P188的濃度的增加，相變溫度會升高，且當(dāng)P407為20%，P188為3%時最接近鼻腔溫度，因此以P407和P188 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為因素，將20%的P407和3%的P188作為中心點，擴大范圍，采用Design-Expert軟件進行效應(yīng)面優(yōu)化，用星點設(shè)計-效應(yīng)面法篩選蒼芷溫敏凝膠最優(yōu)處方。

以P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X，%，W/W)，P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Y，%，W/W)，取值范圍 X：15%～25%，Y：1%～5%；試驗水平值及試驗操作值按照星點設(shè)計原理確定，分別測定加入藥物后凝膠的相變溫度。并以該溫度作為響應(yīng)值進行優(yōu)化，目標(biāo)溫度為32 ℃。

1.3 制劑的體外釋放研究

1.3.1 對照品溶液的制備

在10 mL的容量瓶中加入精密稱取的對照品綠原酸4.3 mg并用甲醇定容到10 mL，搖勻獲得對照品溶液[10]。

1.3.2 色譜條件

0.2%的磷酸水溶液作為流動A相，甲醇作為流動B相；色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；梯度洗脫：初始濃度：A：30%，B：70%；30 min，A：10%，B：90%；檢測波長為320 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，對照品溶液進樣后記錄色譜圖。

1.4 方法學(xué)驗證

1.4.1 線性關(guān)系分析

取0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2 mL對照品溶液于2 mL容量瓶，甲醇稀釋定容，在上述色譜條件下取10 μL進樣測定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以不同進樣量為橫坐標(biāo)，縱坐標(biāo)為對照品峰面積，計算回歸方程，分析線性范圍。

1.4.2 精密度檢驗

取適量對照品溶液，在上述色譜條件下進樣6次(進樣量為10 μL)[11]，檢測其峰面積，保留時間，計算RSD值綠原酸為0.04%，小于2%，表明實驗精密度良好。

1.4.3 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，以上述色譜條件下，選擇在0，2，4，6，8，10 h分別進樣，然后記錄RSD值[12]，為0.50%，小于2%，表明供試品溶液在放置10 h后測定時，綠原酸較為穩(wěn)定。

1.4.4 供試品溶液制備及處理(釋放實驗)

將泊洛沙姆407，188制備的原位凝膠與白芷、蒼耳子提取物混勻得到鼻用溫敏凝膠物，然后將溫敏凝膠物利用透析袋法進行釋放，利用此釋放液(NaHCO32.56 g；NaCl 7.91 g；CaCl20.51 g；KCl 3.68 g適量純水溶解定容至1000 mL)進行釋放，置于34 ℃水浴中進行磁力攪拌，取10 min，30 min，60 min，120 min，180 min分別取1 mL進行釋放研究，每次取1 mL對應(yīng)的需要再補充1 mL釋放液。將不同時間段的釋放液通過0.22 μm微孔濾過膜進入進樣小瓶內(nèi)，然后通過高效液相進行含量測定，供試品溶液進樣后記錄色譜圖。

1.4.5 樣品含量測定

取10 min、30 min、60 min、120 min、180 min的釋放液，檢測樣品中綠原酸的含量照3.2項下進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 效應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

以表1為因素水平設(shè)計的試驗結(jié)果及相變溫度結(jié)果見表2。

表1 星點設(shè)計因素水平表

表2 星點試驗設(shè)計結(jié)果

相變溫度T的等高線見圖1，三維立體關(guān)系見圖2。有研究報道表明人體鼻腔溫度平均為34 ℃，考慮到凝膠由室溫到達鼻腔溫度的傳熱滯后性及鼻腔粘液會對凝膠有稀釋作用使得膠凝溫度升高，故選擇低于鼻腔生理溫度，高于室溫作為篩選目標(biāo)，所以理想溫度控制在31～33 ℃之間，使用前為液體，便于滴用，到達鼻腔后變?yōu)槟z，增加藥物在鼻腔內(nèi)的滯留時間，提高生物利用度。取中間值32 ℃為目標(biāo)溫度，根據(jù)圖1及Design-Expert優(yōu)化結(jié)果可得25組解，其中軟件給出的最優(yōu)解為P407用量18.26%，P188用量3.65%。此外，表3和圖3數(shù)據(jù)表明實際值與預(yù)測值較為接近，說明擬合較好。

圖1 P407和P188的濃度對膠凝溫度影響的等高線圖

圖2 P407和P188的濃度對膠凝溫度影響的3D效應(yīng)圖

表3 蒼芷溫敏凝膠處方效應(yīng)面優(yōu)化驗證結(jié)果

圖3 溫度的真實值和預(yù)測值的對比圖

2.2 色譜結(jié)果

本實驗中用紫外光掃描在200～600 nm波長范圍內(nèi)的綠原酸對照品溶液，320 nm處有最大吸收峰。在本次實驗前，對色譜條件中的流動相進行了選擇，包括：甲醇-0.2%磷酸溶液，甲醇-2%磷酸溶液，通過綠原酸與其它有效成分之間的分離效果，最終確定選擇甲醇-0.2%磷酸緩沖溶液作為本次實驗的流動相。本次以HPLC法檢測蒼芷中綠原酸成分的含量，結(jié)果表明此方法操作較簡單，檢測精密度，重復(fù)性，線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度符合相關(guān)規(guī)定，能準(zhǔn)確，客觀檢出產(chǎn)品中有效成分的含量，這對提高藥物質(zhì)量，確保藥物用藥安全有重要意義。蒼芷中綠原酸質(zhì)量濃度在0.000800～3.440000 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；穩(wěn)定性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值(RSD)，精密度相對偏差值(RSD)均小于2%，說明兩者在實驗中都良好。歐前胡素在該法中無明顯譜峰，按照文獻類似方法操作也未見歐前胡素峰。取不同時間段的釋放液，檢測樣品中綠原酸的含量，見表5。

圖4 綠原酸色譜圖

表4 回歸方程和線性范圍

圖5 供試品溶液色譜圖

表5 樣品中綠原酸的含量

2.3 討 論

本研究利用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化處方得到了鼻用蒼芷溫敏凝膠的最優(yōu)處方。通過高效液相色譜法進行含量測定時發(fā)現(xiàn)，只能測定以綠原酸為標(biāo)準(zhǔn)物測定蒼耳含量，不能將白芷同時測出，這可能與歐前胡素結(jié)構(gòu)有關(guān)，需要進一步研究白芷的檢測手段。實驗過程中發(fā)現(xiàn)制備含藥凝膠與空白凝膠略有不同，由于藥物分散于空白凝膠還需加少量水，影響成膠及分散，最好將藥物與泊洛沙姆同時溶脹。此外釋放行為表明蒼芷鼻用溫敏凝膠在32 ℃以上條件下進行釋放，具有一定緩釋作用，可延長藥物在鼻腔中的滯留時間。

3 結(jié) 論

本實驗對蒼芷鼻用溫敏原位凝膠的制備工藝進行了研究，發(fā)現(xiàn)該制劑常溫下呈液體，預(yù)期給藥后能夠在鼻粘膜上迅速形成原位凝膠，具有一定緩釋作用，可延長藥物在鼻腔內(nèi)的滯留時間，應(yīng)用前景良好。