在線液相色譜-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用快速分析煙葉中的西柏三烯二醇

黃 志, 畢艷玖, 沙云菲, 謝雯燕, 吳 達(dá), 劉百戰(zhàn), 劉太昂

(1.上海煙草集團(tuán)技術(shù)中心,上海200082;2.上海大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,上海200444)

西柏三烯二醇是煙草中重要的西柏烷類化合物(cembranoids),主要存在于煙葉和煙花的表面分泌物中[1-3].作為重要的致香前體物,大部分西柏三烯二醇在調(diào)制和陳化過程中會(huì)降解生成茄酮等香味成分,因而對煙葉的香氣風(fēng)格和品質(zhì)具有重要影響[4-5].與此同時(shí),西柏三烯二醇還具有抑制腫瘤生長、抗菌、調(diào)節(jié)植物生長以及抑制尼古丁感受等作用[6-9],因而受到許多研究人員的關(guān)注,成為了一個(gè)非常熱點(diǎn)的研究對象.對西柏三烯二醇進(jìn)行分析研究,不僅可以提升對煙葉內(nèi)在品質(zhì)的認(rèn)識(shí),而且對煙草衍生產(chǎn)品的開發(fā)也具有重要的應(yīng)用價(jià)值.

煙葉表面的西柏三烯二醇有兩個(gè)異構(gòu)體,分別為α-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇(αcembratrien-4,6-diol,α-CBT-diol)和β-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇(β-CBT-diol)[10].Severson等[11]利用二氯甲烷提取煙葉表面分泌物,然后采用氣相色譜/質(zhì)譜(gas chromatography/mass spectrometry,GC/MS)聯(lián)用技術(shù)實(shí)現(xiàn)了α-CBT-diol和β-CBT-diol的有效分離鑒定.煙草行業(yè)中已有的西柏三烯二醇推薦標(biāo)準(zhǔn)檢測方法需要經(jīng)過復(fù)雜的前處理操作以及衍生化反應(yīng)步驟,極易造成樣品損失,導(dǎo)致檢測結(jié)果的可靠性較低[12].Ren等[13]嘗試采用紫外檢測高效液相色譜(high performance liquid chromatography-ultraviolet,HPLC-UV)對西柏烷類化合物進(jìn)行檢測,但由于樣品化學(xué)成分復(fù)雜、干擾較大,檢測分析的效果并不理想.

本研究針對行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢測方法中前處理步驟復(fù)雜的問題,建立了以超聲波輔助溶劑萃取技術(shù)[14],結(jié)合在線液相色譜-氣相色譜/質(zhì)譜(liquid chromatography-GC/MC,LC-GC/MS)聯(lián)用技術(shù)[15]對煙草中的西柏三烯二醇進(jìn)行快速分析的方法.超聲波輔助溶劑萃取技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)煙草樣品西柏三烯二醇的快速提取.在線LC-GC/MS系統(tǒng)的第一維凝膠滲透液相色譜不僅可以實(shí)現(xiàn)樣品的大體積進(jìn)樣,提高檢測的靈敏度,同時(shí)也可以有效去除會(huì)對西柏三烯二醇分析產(chǎn)生不利影響的干擾物質(zhì),起到簡化樣品前處理的作用.同時(shí),第二維GC/MS分析亦可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對西柏三烯二醇異構(gòu)體的有效分離分析,為煙草樣品中西柏三烯二醇的快速高效分析提供重要的技術(shù)支撐.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用試劑及材料如下:正十七烷醇(n-heptadecanol,NHE)和二十烷酸甲酯(methylicosanoate,MAA)購自美國Acros Organics公司;N,O-雙-三甲基三氟乙酰胺V(BSTFA)：V(TMCS)=99：1(純度為98%)、二氯甲烷(色譜純)、乙腈(色譜純)購自TEDI公司;其余試劑均為分析純.實(shí)驗(yàn)所用煙葉樣品由上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供.

本實(shí)驗(yàn)所用儀器如下:Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司);Vortex-Genie 2多功能旋渦混合器(美國Scientific Industries公司);AE200型電子分析天平(感量為0.000 1 g,瑞士Mettler Toledo公司);真空干燥箱(美國Thermo Scientific公司);RJ-LDL-50G多管離心機(jī)(中國瑞江公司).在線LC-GC/MS聯(lián)用系統(tǒng)中第一維液相儀器為Agilent 1290液相色譜儀(美國Agilent公司),配備自動(dòng)進(jìn)樣器、二元泵、二極管陣列檢測器(diode-array-detector,DAD);第二維氣相儀器為Agilent 7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司),配備On-Column進(jìn)樣口.

1.2 煙葉中西柏三烯二醇的提取

取新鮮煙葉冷凍干燥后粉碎,過80目篩,篩下物為實(shí)驗(yàn)用煙樣粉末,-20°C冷藏,備用.稱取0.5 g煙樣粉末置于100 mL錐形瓶中,加入15 mL乙腈和100μL含100μg/mL MAA的乙腈溶液,超聲萃取30 min后經(jīng)0.22μm濾膜過濾.所得濾液濃縮至1 mL置于4°C備用.

1.3 西柏三烯二醇的BSTFA硅烷化衍生

吸取100μL西柏三烯二醇提取液于樣品瓶中,加入100μL V(BSTFA)：V(TMCS)=99：1,渦旋震蕩3 min,在75°C下密閉衍生化反應(yīng)30 min.反應(yīng)完成后冷卻至室溫進(jìn)行GC/MS分析.

1.4 LC-GC/MS分析

液相色譜條件:上樣量為10μL,色譜柱為Waters Styragel HR 0.5凝膠色譜柱(5μm×300 mm×4.6 mm i.d.),流動(dòng)相為二氯甲烷,流速為0.25 mL/min,柱溫為30°C.DAD檢測波長為254 nm.

氣相色譜條件:采用VDB-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25μm)毛細(xì)管色譜柱分離,載氣為氦氣,柱流速為1.2 mL/min,升溫程序?yàn)?0°C保持14 min,以20°C/min升溫至210°C,接著以0.5°C/min升溫至220°C,然后以15°C/min升溫至300°C,保持5 min.

質(zhì)譜條件:傳輸線溫度為280°C,離子源溫度為230°C,四級桿溫度為170°C,溶劑延遲20 min,電離方式為電子轟擊離子(electron impact ion,EI)源,電離能量為70 eV,質(zhì)量掃描范圍為50～800 amu.

2 結(jié)果與討論

2.1 煙葉中西柏三烯二醇的LC-GC分析

煙草中西柏三烯二醇分子的分子量為306.凝膠色譜是根據(jù)物質(zhì)的相對分子質(zhì)量大小進(jìn)行區(qū)分的.相對分子質(zhì)量大的保留時(shí)間較短,相對分子質(zhì)量小的保留時(shí)間較長.因此,在線LC-GC/MS聯(lián)用系統(tǒng)中的第一維凝膠滲透色譜不僅可以保證西柏三烯二醇衍生物分子在相對窄的時(shí)間窗口內(nèi)出峰,同時(shí)也可以有效地去除復(fù)雜樣品體系中對儀器和西柏三烯二醇分析結(jié)果有不利影響的色素等大分子物質(zhì),起到凈化煙葉西柏三烯二醇樣品的作用.與此同時(shí),相較于已有的復(fù)雜繁瑣的提取過程,本實(shí)驗(yàn)的前處理過程更為簡單快速,靈敏度和效率也很高,更適用于大批量樣品的分析測試.

由于西柏三烯二醇目前尚未有商品化的標(biāo)準(zhǔn)品,質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)譜庫中也沒有相對應(yīng)的譜圖,因此給西柏三烯二醇分子的質(zhì)譜定性分析造成了一定的困難.本實(shí)驗(yàn)選用浙江東昌的烤后香料煙煙葉,經(jīng)過前處理后進(jìn)行測定分析,并對比分析了已有數(shù)據(jù)[16]與本實(shí)驗(yàn)中所得的質(zhì)譜碎片,確定了2個(gè)西柏三烯二醇分子異構(gòu)體α-CBT-diol和β-CBT-diol三甲基硅烷化后的EI特征碎片離子(見圖1和表1),并以此為基礎(chǔ)對西柏三烯二醇分子進(jìn)行LC-GC定位研究.

2.2 煙葉中西柏三烯二醇的LC-GC定位

本實(shí)驗(yàn)對西柏三烯二醇提取液進(jìn)行了在線LC-GC/MS分析,圖2為第一維液相分離所得的色譜圖.本實(shí)驗(yàn)以1 min為切割單位,對第一維色譜圖中的保留時(shí)間區(qū)域7～13 min進(jìn)行第二維GC/MS分析,初步篩選出西柏三烯二醇衍生物在第一維分離中的保留時(shí)間區(qū)域?yàn)?0～11 min.為了進(jìn)一步確定西柏三烯二醇衍生物在第一維分離中的保留時(shí)間區(qū)域,本實(shí)驗(yàn)以0.1 min為時(shí)間調(diào)整單位,考察了西柏三烯二醇衍生物在9.5～10.0 min以及11.0～11.5 min這兩個(gè)保留時(shí)間區(qū)域的出峰情況,確定了西柏三烯二醇衍生物在第一維分離中的保留時(shí)間區(qū)域?yàn)?.9～10.9 min(見圖2中的虛線部分).

圖1 西柏三烯二醇分子三甲基硅烷化后特征碎片離子EI質(zhì)譜Fig.1 EI mass spectra of characteristic ions of cembratriene-diols after trimethylsilanation in

表1 西柏三烯二醇分子三甲基硅烷化后的EI質(zhì)譜特征碎片離子Table 1 Characteristic ions of cembratriene-diols after trimethylsilanation in EI mass spectra

圖2 西柏三烯二醇的第一維LC分離色譜圖Fig.2 Chromatogram of cembratriene-diols in the first dimensional LC seperation

根據(jù)西柏三烯二醇衍生物在EI質(zhì)譜的碎裂特點(diǎn),第二維分離選用了選擇離子掃描(select ion moniring,SIM)模式進(jìn)行GC/MS分析,所得質(zhì)譜圖如圖3所示,定性以及定量離子如表2所示.由圖3可以發(fā)現(xiàn),在保留時(shí)間區(qū)域28.0～30.5 min之間出現(xiàn)了2個(gè)西柏三烯二醇分子的衍生化色譜峰.這表明西柏三烯二醇衍生物分子的保留時(shí)間區(qū)域主要在28.0～30.5 min之間,可基于此進(jìn)行后續(xù)的方法學(xué)考察以及實(shí)際樣品分析.

2.3 所構(gòu)建方法的線性、重復(fù)性和回收率考察

由于西柏三烯二醇尚未有商品化的標(biāo)準(zhǔn)品,本實(shí)驗(yàn)選取了與西柏三烯二醇分子量相近且同樣需要硅烷化衍生的NHE進(jìn)行方法的線性及回收率考察.在相同條件下對同一樣品進(jìn)行9次平行測定.結(jié)果顯示,西柏三烯二醇的2個(gè)異構(gòu)體α-CBT-diol,β-CBT-diol和NHE測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)分別為0.57%,0.72%和0.86%,表明這一方法具有良好的重現(xiàn)性.

圖3 西柏三烯二醇的第二維GC/MS分析色譜圖Fig.3 Chromatogram of cembratrene-diols in the sencond dimensional GC/MS analysis

表2 三甲基硅烷化西柏三烯二醇在第二維GC/MS分析中的保留時(shí)間以及定性定量離子Table 2 Retention time,quantitative and qualitative ions of cembratriene-diols after trimethylsilanation in the sencond dimensional GC/MS analysis

準(zhǔn)確稱取NHE 500 mg,精確至0.1 mg,用乙腈溶解后分別置于10 mL容量瓶中,加入乙腈定容,搖勻,得到標(biāo)準(zhǔn)貯備液.分別準(zhǔn)確稀釋NHE標(biāo)準(zhǔn)貯備液,得到0.01～0.10μg/μL之間不同質(zhì)量濃度梯度的NHE標(biāo)準(zhǔn)溶液,并將不同質(zhì)量濃度的NHE標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到煙葉樣品中進(jìn)行LC-GC/MS分析.采用內(nèi)標(biāo)法定量,以NHE與內(nèi)標(biāo)MAA的峰面積比為縱坐標(biāo)(y),NHE質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x,μg/μL)進(jìn)行回歸分析,得到NHE質(zhì)量濃度的回歸方程為y=8.53×10?5x,相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 3.這一結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的在線LC-GC/MS方法所得NHE質(zhì)量濃度結(jié)果具有良好的線性關(guān)系.

取一定量的NHE加入到已知NHE質(zhì)量濃度的煙葉樣品中,并按低、中、高3個(gè)濃度水平進(jìn)行NHE的添加.將添加與未添加標(biāo)樣的樣品平行進(jìn)行前處理和定量分析,并進(jìn)行加標(biāo)回收率的測定,結(jié)果如表3所示.可知,NHE的加標(biāo)回收率在85.13%～92.47%之間.這一結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的在線LC-GC/MS方法可滿足煙葉樣品中西柏三烯二醇的定量要求.

表3 NHE的加標(biāo)回收率Table 3 Recoveries of standard addition of NHE

2.4 不同煙葉中西柏三烯二醇含量的比較分析

本實(shí)驗(yàn)將上述方法應(yīng)用于不同地區(qū)K326青煙葉中西柏三烯二醇含量的比較分析中,其中4種樣品分別為2013年云南昆明宜良K326中部成熟期青煙葉、2013年云南玉溪江川K326中部成熟期青煙葉、2013年河南襄縣K326中部成熟期青煙葉以及2013年貴州遵義K326中部成熟期青煙葉.每個(gè)樣品均為兩組平行測定,經(jīng)過簡單前處理后進(jìn)行在線LC-GC/MS分析,所得不同產(chǎn)地K326中部成熟期青煙葉中西柏三烯二醇的相對含量對比結(jié)果如圖4所示.

圖4 不同產(chǎn)地K326中部成熟期青煙葉中西柏三烯二醇的相對含量Fig.4 Relative amounts of cembratriene-diols extracted from central part of fresh K326 tobacco leaves from diあerent planting areas

由于α-CBT-diol和β-CBT-diol只是分子結(jié)構(gòu)上具有差異性,二者的質(zhì)譜響應(yīng)值基本相同,因此本實(shí)驗(yàn)以2013年云南昆明宜良K326中部成熟期青煙葉的α-CBT-diol測定結(jié)果為基準(zhǔn),分別對所有樣品的西柏三烯二醇分子含量進(jìn)行了歸一化處理.由圖4可知:青煙葉中α-CBT-diol的含量均低于β-CBT-diol,昆明宜良樣品中的西柏三烯二醇含量最低,貴州遵義的含量最高.分析國家氣象科學(xué)數(shù)據(jù)共享服務(wù)平臺(tái)的相關(guān)信息可知:云南昆明以及玉溪為亞熱帶季風(fēng)氣候,2013年7—8月間的降水多,因而極易導(dǎo)致煙葉生長過程中西柏三烯二醇等表面物質(zhì)含量降低;河南襄縣2013年8—9月的氣溫高,降水不多,使得煙葉生長過程中西柏三烯二醇等表面物質(zhì)含量較高;而貴州遵義2013年4—5月的降水偏少,因此西柏三烯二醇等表面物質(zhì)含量損失較少,測得的含量最高.

3 結(jié)束語

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了一種快速分析煙草中西柏三烯二醇含量的方法.樣品首先經(jīng)過超聲波輔助溶劑萃取,之后通過在線LC-GC/MS對煙草中的西柏三烯二醇進(jìn)行分析.整個(gè)萃取過程簡單便捷,在線LC-GC/MS分析的RSD低于1%,回收率高于85%,表明整個(gè)定量分析具有較高的可靠性.比較分析了不同地區(qū)K326青煙葉中西柏三烯二醇含量,發(fā)現(xiàn)青煙葉中α-CBT-diol的含量均低于β-CBT-diol,且與種植地區(qū)的氣候條件呈現(xiàn)較強(qiáng)的正相關(guān)性.這一結(jié)果也進(jìn)一步表明,本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的方法適用于煙草中西柏三烯二醇含量的大規(guī)?？焖俜治鎏幚?