腺樣囊性癌TrkC差異表達(dá)的PDX模型的建立與鑒定*

馬廷耀，王雪蓮，陳曉紅，許春萍，武駿，江凌燕，許洪波，周晶，宋曉明，李文偉

100730 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科 (馬廷耀、王雪蓮、陳曉紅、武駿、江凌燕、許洪波、周晶);100716 北京，亦康(北京)醫(yī)藥科技有限公司(許春萍、宋曉明、李文偉)

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)是源于分泌腺的一種罕見腫瘤，最常發(fā)生在頭頸部的小唾液腺，占所有唾液腺惡性腫瘤的約10%～22%[1-2]。這類疾病的臨床特點(diǎn)為初期生長緩慢、周圍神經(jīng)侵襲性、晚期局部隱匿性擴(kuò)散與多發(fā)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中以肺部轉(zhuǎn)移最為多見；患者在5年后生存率急劇下降，10年的生存率較低(37%～57%)[3]。

目前，該病的主要治療方式仍是原發(fā)部位的手術(shù)治療，術(shù)后予以輔助放療。但ACC的嗜神經(jīng)侵襲(perineural invasion,PNI)特性易導(dǎo)致手術(shù)切緣陽性，增加遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。而對(duì)于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，尚沒有確切療效的細(xì)胞毒性藥物及針對(duì)性的靶向藥物。因此嗜神經(jīng)性是ACC預(yù)后不良的關(guān)鍵因素，也是藥物研發(fā)的重要突破點(diǎn)。有研究表明，神經(jīng)營養(yǎng)因子3(neurotrophic factor，NT-3)及其特異性受體原肌球蛋白受體激酶C(trypomyosin-receptor C，TrkC)在涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)中, 通過調(diào)節(jié)SACC細(xì)胞與施萬細(xì)胞(Schwann cells，SC)的相互作用，促進(jìn)了PNI和SACC患者的預(yù)后不良。通過阻斷NT-3 / TrkC軸來中斷SACC細(xì)胞與SC的相互作用可能是SACC患者中抗PNI治療的有效策略[4]。

針對(duì)ACC的有效藥物研發(fā)，需建立ACC的研究工具。目前，國內(nèi)有ACC的細(xì)胞系兩株，分別是SACC-83、SACC-LM，但這些細(xì)胞系已經(jīng)構(gòu)建有近30年，脫離人體培養(yǎng)時(shí)間過長，丟失較多人體內(nèi)生物學(xué)特性。人源腫瘤異種移植模型(patient-derived tumor xenograft，PDX)是將新鮮腫瘤組織切成組織小塊直接移植至免疫缺陷小鼠體內(nèi),從而很好地保持了腫瘤的異質(zhì)性。由于沒有經(jīng)過任何人工培養(yǎng),其生物學(xué)特性保持地更為完整，從而與臨床相似度更高，是目前研究最合適的腫瘤動(dòng)物模型。有鑒于此，我們嘗試從北京同仁醫(yī)院頭頸外科收集新鮮的ACC腫瘤組織，藉此構(gòu)建有TrkC表達(dá)差異的PDX模型研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 新鮮腫瘤組織采集

1.1.1 組織收集來源 本次研究共收集了10例患者腫瘤組織進(jìn)行了PDX實(shí)驗(yàn)。10例患者的腫瘤組織均經(jīng)我院病理科確診為ACC組織。其中成功5例，3例完成了鑒定。在完成鑒定的3例患者中，一例(ACC001)腫瘤組織來源于頭皮轉(zhuǎn)移灶，病理類型為實(shí)性型；一例(ACC004)來源于右側(cè)上頜竇，病理類型為篩狀型；一例(ACC008)來腫瘤組織源于左側(cè)上頜竇，病理類型為高級(jí)別轉(zhuǎn)化型。另外兩例的PDX腫瘤組織尚在鑒定中，一例(ACC009)來源于左側(cè)鼻腔，病理類型為混合型；另一例(ACC011)來源于會(huì)厭喉面，病理類型為實(shí)性型。本次研究獲得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會(huì)審批立項(xiàng)(編號(hào)：2016-09-13)。

1.1.2 主要器具 無菌操作器械：眼科剪、眼科鑷子、手術(shù)剪、手術(shù)鉗、手術(shù)刀、無菌培養(yǎng)皿(直徑90 mm)、無菌手套、手術(shù)衣、口罩、帽子、無菌隔離服。其他配套器械：3 L保溫壺、冰袋、標(biāo)本管(50 mL BD離心管)、冰箱。

1.1.3 試劑 青霉素(0.48g/瓶，80萬IU)，鏈霉素(1g/瓶，100萬IU)，改良型RPMI-1640培養(yǎng)基，D-Hanks溶液。

1.1.4 組織保存液的配制 使用含100IU/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基，調(diào)整pH值為7.4，0.22 μm膜抽濾滅菌，分裝到標(biāo)本管中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.5 標(biāo)本采集 手術(shù)摘取新鮮腫瘤組織由主刀醫(yī)生進(jìn)行。醫(yī)師選取質(zhì)量較好的瘤組織，避開潰瘍壞死部位，切取瘤塊體積約為0.5cm × 0.5cm × 1cm左右大小，盡量保證足夠多的腫瘤組織。尤其注意的是要在手術(shù)臺(tái)無菌條件下切剪取瘤組織，保持腫瘤組織標(biāo)本無菌。將取下的腫瘤組織塊放入盛有保存液的標(biāo)本管中，加蓋后塑料薄膜(封口膜)密封保存。將裝有新鮮腫瘤標(biāo)本試管放入裝有冰袋的保溫壺，送交腫瘤實(shí)驗(yàn)室。整個(gè)運(yùn)送過程在6小時(shí)內(nèi)完成。

1.2 建立人ACC PDX皮下移植瘤模型

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 NCG小鼠, 江蘇集萃藥康生物科技有限公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障系統(tǒng) 1)籠具(規(guī)格：370mm × 180mm × 157mm)：名稱：獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具；型號(hào)：獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)(independent ventilation system,IVC)，VNP72G3-2型；購自蘇州市蘇杭科技器材有限公司；2)飼養(yǎng)環(huán)境：無特定病原體屏障環(huán)境中，IVC飼養(yǎng)：恒定溫度(22℃～26℃)和濕度(40%～70%)。

1.2.3 主要設(shè)備及器具 包括YT-CJ-2ND+型超凈工作臺(tái)、套管針(棱牌注射穿刺針)、眼科剪、眼科鑷、康寧一次性使用培養(yǎng)皿、YDS-175-216型液氮生物容器、凍存管、速凍管、游標(biāo)卡尺。

1.2.4 動(dòng)物飼養(yǎng)及使用 1)每只籠具的標(biāo)記內(nèi)容;2)采用打耳洞法動(dòng)物標(biāo)記;3)動(dòng)物無菌飼養(yǎng)尾箱，工作照明12小時(shí)，動(dòng)物照明12小時(shí);4)觀察動(dòng)物活動(dòng)指標(biāo)。

1.2.5 腫瘤原代接種方法 開啟超凈工作臺(tái)，將改良型RPMI-1640培養(yǎng)基分別倒入3個(gè)培養(yǎng)皿中，從保溫壺中取出標(biāo)本管，用眼科鑷將其中的腫瘤組織放到一只培養(yǎng)皿中清洗，清洗后放入第二個(gè)培養(yǎng)皿，持眼科剪與眼科鑷，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行修剪，剪除脂肪、纖維及壞死組織，將組織塊放到另一只培養(yǎng)皿中，然后將其修剪成約2mm×2mm×2mm。每個(gè)套管穿刺針芯內(nèi)放入1～2個(gè)瘤塊，注入酒精消毒后的動(dòng)物背部皮下進(jìn)行原代接種。每只動(dòng)物共接種四個(gè)點(diǎn)，分別是左、右前肢肩胛骨皮下脂肪墊處，與之對(duì)應(yīng)的左、右靠臀部皮下處。

1.2.6 腫瘤傳代接種 頸椎脫位方法處死第一代(標(biāo)記為P0)接種的動(dòng)物，酒精消毒皮膚。使用眼科剪剪開瘤體處皮膚，眼科鑷分離瘤體與皮膚，邊分離邊剪開皮膚，直至將整個(gè)瘤體分離并放入盛有1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。使用眼科剪與眼科鑷修剪瘤體，剪除脂肪、纖維及壞死組織，選取魚肉樣長勢旺盛的瘤組織塊做轉(zhuǎn)接。移至另一盛有1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，將瘤塊修剪成2mm×2mm×2mm大小，轉(zhuǎn)接方法和轉(zhuǎn)接部位與腫瘤原代接種方法相同。將第一代(P0)小鼠皮下腫瘤組織轉(zhuǎn)接到第二代(P1)3只小鼠皮下。余下瘤塊分別用于作病理、速凍和凍存。按上述方法，將第二代(P1)腫瘤一直轉(zhuǎn)接到第四代(P5)供長期保存。從第三代(P4)開始測量小鼠體重和腫瘤體積。用游標(biāo)卡尺測量小鼠活體腫瘤的長徑a和短徑b，按照公式V=1/2a×b2計(jì)算活體腫瘤的體積，繪制出生長曲線圖。

1.3 免疫組化染色方式

1.3.1 標(biāo)本處理 標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制備5 μm厚度空白切片(10張/標(biāo)本)，蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色證實(shí)為ACC。

1.3.2 主要試劑 TrkC兔抗人單克隆抗體(克隆系)購自Cell Signaling Technology 公司，免疫組化二抗試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3.3 檢測方法及結(jié)果判讀 采用免疫組化染色PV二步法試劑盒檢測ACC切片組織中TrkC表達(dá)，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，以已知ACC組織為陽性對(duì)照，以兔源IgG 單克隆抗體替代一抗做陰性對(duì)照。Leica光學(xué)顯微鏡下觀察檢測結(jié)果，陽性信號(hào)為棕色，TrkC定位于細(xì)胞膜。

2 結(jié) 果

2.1 患者臨床資料

5例完成PDX建立的患者中，初發(fā)病例3例，占60%(3/5)，復(fù)發(fā)病例2例，占40%(2/5)。5例患者的臨床信息匯總?cè)缦?表1)。一例患者腫瘤原發(fā)部位為左側(cè)顳下窩，病理類型為實(shí)性型，治療方式為手術(shù)切除后行根治性放療，33個(gè)月后復(fù)發(fā)，52個(gè)月發(fā)生全身轉(zhuǎn)移；一例患者腫瘤原發(fā)部位為右側(cè)上頜竇，病理類型為篩狀型，治療方式為手術(shù)切除，取材組織來源于原發(fā)灶；一例患者為男性，年齡66歲，腫瘤原發(fā)部位為左側(cè)上頜竇，病理類型為高級(jí)別轉(zhuǎn)化型，治療方式為手術(shù)切除，19個(gè)月后復(fù)發(fā)，二次手術(shù)切除后行根治性放療，取材組織來源于鼻咽部復(fù)發(fā)灶；一例患者為男性，年齡67歲，腫瘤原發(fā)部位為左側(cè)鼻腔，病理類型為混合型，治療方式為手術(shù)切除后行根治性放療，取材組織來源于左側(cè)鼻腔；一例患者為男性，年齡58歲，腫瘤原發(fā)部位為會(huì)厭喉面，病理類型為實(shí)性型，治療方式為手術(shù)切除后行根治性放療，取材組織來源于喉腫物。5例患者的病理信息匯總?cè)缦?表2)。

2.2 ACC PDX模型建立

一共接種10例，確定生長的模型有5例：其中1例處于P4代(ACC001)，1例處于P3代(ACC004)，1例處于P1代(ACC008)，2例處于P0代(ACC009與ACC011)；確定建模失敗的有5例?？傮w而言，建模成功率為50%。

2.3 PDX病理分析

在裸鼠體內(nèi)成功荷瘤后，我們對(duì)比了成瘤前、后的HE染色和免疫組化檢查，觀察標(biāo)本荷瘤前后的組織類型變化，結(jié)果顯示病理特點(diǎn)和腫瘤形態(tài)基本一致(圖1)。ACC001病人中可見實(shí)性型ACC，腫瘤細(xì)胞為基底樣，胞質(zhì)少，呈實(shí)性巢團(tuán)狀在纖維間質(zhì)內(nèi)浸潤性生長，纖維間質(zhì)黏液樣變性，而ACC001 PDX中，腫瘤細(xì)胞為基底樣，胞質(zhì)少，大部分呈實(shí)性巢團(tuán)狀生長方式，形態(tài)同ACC001病人；ACC004病人及PDX：篩狀型ACC，如圖所示腫瘤大部分呈篩狀生長方式，此型以微囊腔隙的腫瘤細(xì)胞巢為其形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，本例局部可見鱗狀上皮化生；ACC008 PDX：圖片顯示高級(jí)別轉(zhuǎn)化區(qū)域：腫瘤細(xì)胞核多形性、泡狀核、核仁明顯，核分裂像多見，與ACC008病人基本符合。

表1 5例PDX患者臨床信息

Table 1. Clinical Information of 5 PDX Patients

NumAgeSexPrimary siteHis-subTreatmentFollow-up (month)LR (month)DM (month)SurvivalGACC00133Fe-maleLeft infra-temporal fos-saSolidS+C+R5533Systemic metastasis (52)DeathP4ACC00456Fe-maleRight maxil-lary sinusCribriformS+R13-Lumbar metastasis (3)Sur-TP3ACC00866MaleLeft maxil-lary sinusHGTS+R3219Lung metastasis (17)Sur-TP1ACC00967MaleLeft nasal cavityMixed typeS+R3--Sur-TP0ACC01158MaleEpiglottisSolidS+R2--Sur-TP0

PDX=patient-derived tumor xenograft; Num=number; His-sub=histological subtype; LR=local recurrence; DM=distant metastasis; G=generation; S+C+R=surgery+chemotherapy+radiotherapy; S+R=surgery+radiotherapy; Sur-T=survival with tumor; HGT=high grade transformation.

表2 5例PDX患者病理信息

Table 2. Pathological Information of 5 PDX Patients

NumHis-subki-67P53P63CD117S100PNIITTB-IACC001Solid25%+-++///ACC004Cribriform10%-+++//+ACC008HGT30%+++-+-+ACC009Mixed type25%-++++-/ACC011Solid2%-++++-+

PDX=patient-derived tumor xenograft; Num=number; His-sub=histological subtype; PNI=perineural invasion; ITT=intravascular tumor thrombus; B-I=bone invasion; HGT=high grade transformation.

圖1 患者及PDX腫瘤組織病理形態(tài)對(duì)照(20×10)

Figure 1. Histopathology of Tumors in PA and PDX (20×10)

Most of the tumor tissue of patients (acc001 and acc004) were used for inoculation, and only a few were fixed, so there were few tumor cells. The pathological characteristics and morphology of an xenograft tumor was consistent with those of a patient’s tissue. PA: Patient; PDX: Patient-derived tumor xenograft.

2.4 TrkC的免疫組化及PDX腫瘤生長曲線

TrkC在ACC004 PDX模型腫瘤組織中不表達(dá)，在ACC001和ACC008 PDX模型腫瘤組織中呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)，其陽性率接近百分之百(圖2)。根據(jù)前文中所述實(shí)驗(yàn)方法，計(jì)算活體腫瘤體積，繪制出生長曲線圖(圖3)。因ACC008為P1代，暫不到量瘤的代數(shù)，P3以后才看腫瘤生長狀態(tài)量，圖中僅描述了ACC001與ACC004的情況?？煽闯瞿[瘤生長速度較快，且呈前期緩慢，后期加快的趨勢。ACC001生長速度明顯快于ACC004。

圖2 3例PDX中TrkC的免疫組化結(jié)果 (20 X 10)

Figure 2. Immunohistochemical Results of TrkC in 3 Cases of PDX (20×10)

ACC004: Negative; ACC001: Positive; ACC008: Strong positive.

圖3 PDX腫瘤生長曲線

Figure 3. Tumor Growth Curve of Patient-Derived Tumor Xenograft

3 討 論

ACC是一種原發(fā)于腺體的惡性腫瘤，也是頭頸部唾液腺腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一。ACC最顯著的臨床特征是局部復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高，PNI的發(fā)生率可高達(dá)48%[5]。據(jù)報(bào)道，患者的5年生存率為80.8%，局部復(fù)發(fā)率為40%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為3.8%，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率為28.5%[6]。影響患者預(yù)后的主要因素是局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，特別是肺部轉(zhuǎn)移。由于ACC對(duì)普通的細(xì)胞毒化療藥物不敏感，故目前對(duì)該病的肺部轉(zhuǎn)移尚沒有特別有效的化療藥物治療。另外，靶向治療也沒有顯示出穩(wěn)定的臨床療效，免疫治療也因?yàn)檫@類腫瘤的突變負(fù)荷低而沒有顯示出明顯的臨床應(yīng)答反應(yīng)。因此，篩選有效藥物控制腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是目前ACC研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。

篩選針對(duì)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的有效藥物需要建立藥物篩選的合理模型。然而，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前國際上常用6株的ACC細(xì)胞系(即ACC2、ACC3、ACCM、ACCNS、ACCS和CAC2)存在交叉污染和錯(cuò)誤識(shí)別[7]。而對(duì)于國內(nèi)的ACC細(xì)胞系SACC-83，目前尚不確定其是否存在交叉污染或錯(cuò)誤識(shí)別等問題。即使是沒有被污染的體外細(xì)胞系，由于通常其脫離人體時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間長，多代培養(yǎng)及傳代使得無法完全反映腫瘤在人體內(nèi)的生物學(xué)狀態(tài)，藥效評(píng)價(jià)效果有限。因此，建立原代的動(dòng)物體內(nèi)生長模型，或許是篩選ACC有效藥物的最好方法之一。腫瘤動(dòng)物模型是臨床前評(píng)估抗腫瘤藥物療效和預(yù)測藥物毒性的有效工具，PDX模型是最常用的動(dòng)物模型之一。PDX模型通過直接轉(zhuǎn)移、體內(nèi)培養(yǎng)的方式很好地保留了腫瘤異質(zhì)性，這對(duì)于藥物的研究有極為重要的臨床意義。

ACC具有嗜神經(jīng)生長特性，被侵襲的神經(jīng)組織為腫瘤細(xì)胞提供了良好的庇護(hù)所，導(dǎo)致手術(shù)難以完全切凈。有研究表明，臨床上發(fā)生PNI的SACC患者接受放化療的療效顯著低于無PNI的對(duì)照組患者[8-9]。這說明PNI特性是SACC的重要不良預(yù)后因素。最新的研究表明，PNI的發(fā)生和SC與腫瘤細(xì)胞間存在的一種特殊親和力有關(guān)，這可能是通過神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophin，NT)與其TrkC之間的結(jié)合實(shí)現(xiàn)的[10]。有研究發(fā)現(xiàn)NT-3激活SACC細(xì)胞的TrkC特異性受體，通過下游Ras、Erk1/2、Ark和Bcl信號(hào)通路來提高SACC的侵襲能力[11]。孫沫逸等[12]研究發(fā)現(xiàn)TrkC在無嗜神經(jīng)性的腺泡細(xì)胞癌中無表達(dá)，而ACC中TrkC中陽性率高達(dá)90.6%(29/32)，有無嗜神經(jīng)性侵襲是造成TrkC差異表達(dá)的重要原因。目前暫未發(fā)現(xiàn)有文獻(xiàn)表明TrkC的差異表達(dá)和病理類型有明顯相關(guān)性。因此，針對(duì)TrkC靶向抑制劑的研究有望成為藥物控制ACC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要突破點(diǎn)。

在本研究中，我們收集10例腺樣囊性癌患者的新鮮腫瘤組織，皮下接種至免疫缺陷鼠體內(nèi)。一般情況下，模型建立需2～4個(gè)月，若在6個(gè)月內(nèi)仍未觀察到腫瘤生長，則表示建模失敗[13-15]。成功傳代建立PDX模型5例?？紤]到移植成功率和腫瘤生長的均一性，我們一般選擇P2代以上的腫瘤(即傳代兩次以上)開展體內(nèi)藥效測試。為了保證和患者腫瘤組織的一致性，每次傳代后需要做HE染色確認(rèn)病理組織結(jié)構(gòu)的一致，并且傳代不超過10次。根據(jù)患者免疫組化的表達(dá)差異，可嘗試定制PDX模型，進(jìn)行個(gè)體化藥物治療及放化療敏感性實(shí)驗(yàn)。本研究中病理特點(diǎn)和形態(tài)鑒定一致的有3例，并在3例PDX模型中，檢測出了TrkC的差異表達(dá)。TrkC差異表達(dá)的PDX模型建立有助于評(píng)估TrkC在ACC肺轉(zhuǎn)移進(jìn)展中的影響。如圖3中我們可看到相較于ACC004，ACC001的腫瘤生長速度明顯較快，生長趨勢穩(wěn)定，有望進(jìn)展為肺轉(zhuǎn)移。這一差異的原因或與TrkC的陽性表達(dá)有關(guān)，但因PDX模型例數(shù)較少且無相同病理類型對(duì)照，有待在下一步研究中補(bǔ)充認(rèn)定。此外對(duì)于TrkC表達(dá)陰性的ACC004 PDX模型與表達(dá)陽性的ACC001與ACC008 PDX進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)，有望實(shí)現(xiàn)TrkC靶點(diǎn)抑制劑研發(fā)與療效評(píng)估，極有可能為預(yù)后較差的ACC病理類型提供新的治療思路。

當(dāng)然，PDX模型仍有一些無法避免的缺陷，內(nèi)源性原發(fā)性腫瘤與環(huán)境的相互作用無法通過皮下植入來維持，遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的腫瘤特異趨向性幾乎沒有體現(xiàn)。在未來的研究中，我們需要增加PDX模型數(shù)量，進(jìn)行與患者同步的藥物實(shí)驗(yàn)。通過PDX腫瘤生長曲線進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。

綜上所述，在本項(xiàng)研究中，我們成功建立了ACC PDX小鼠模型中的TrkC差異表達(dá)模型，這將為今后ACC進(jìn)行個(gè)體化的藥物選擇，如根據(jù)TrkC表達(dá)差異，進(jìn)行藥物篩選和設(shè)計(jì)臨床試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

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