《蒲公英多糖鐵的制備及其鐵含量測定》綜合創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)設(shè)計

樊永嬋，李炳川，李沫瑤，張蓮姬,2

(1 延邊大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，吉林 延吉 133002；2 延邊大學(xué)化學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，吉林 延吉 133002)

目前各個高校在高年級開設(shè)綜合性實(shí)驗(yàn)課程，其目的是培養(yǎng)學(xué)生探究精神、創(chuàng)新思維。但現(xiàn)狀不容樂觀，其存在的問題主要有以下幾點(diǎn)：(1)實(shí)驗(yàn)中學(xué)生能夠自主設(shè)計與探索的部分較少。從實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)步驟到思考與討論，都是預(yù)先設(shè)定的，學(xué)生沒有自主探索的機(jī)會。(2)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目內(nèi)容比較陳舊，不利于激發(fā)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)興趣和積極性。(3)學(xué)生很少有綜合運(yùn)用實(shí)驗(yàn)知識、技能的機(jī)會，很容易感知到所掌握的知識和技能是“短截性”的，面對實(shí)際課題仍無從下手。因此，有必要設(shè)計能避免以上現(xiàn)存問題的創(chuàng)新性綜合實(shí)驗(yàn)，提高學(xué)生的創(chuàng)新能力、綜合運(yùn)用知識的能力及分析問題和解決問題能力等。

多糖鐵配合物(PIC)是一種新型補(bǔ)鐵劑[1]，具有良好的療效、穩(wěn)定性、生物活性，近幾年許多學(xué)者致力研發(fā)新型補(bǔ)鐵劑，如當(dāng)歸多糖鐵、大棗多糖鐵等[2]，但目前將關(guān)于多糖鐵的科研成果設(shè)計為本科生綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的尚未見報道。

本創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)題目來源于一項(xiàng)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)科研項(xiàng)目，選用各地區(qū)均廣泛存在的蒲公英為材料，制備一種新型口服補(bǔ)鐵劑。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括多糖的提取及精制、多糖鐵的制備和鐵含量測定[3]，在整個實(shí)驗(yàn)過程中綜合運(yùn)用了學(xué)生所掌握的基本知識和技能，讓學(xué)生感知到學(xué)而有用。

本創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)設(shè)計嘗試將大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)課題成果與實(shí)驗(yàn)教學(xué)相結(jié)合[4]，為深化化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革，提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)中綜合性、創(chuàng)新性，培養(yǎng)高素質(zhì)專業(yè)創(chuàng)新人才提供有效途徑。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

鐵是維持人體主要代謝功能所必需的生命元素，缺鐵會引起缺鐵性貧血及其他疾病?？诜a(bǔ)鐵劑是治療缺鐵性貧血的最有效的方法。傳統(tǒng)補(bǔ)鐵劑如硫酸亞鐵，存在刺激胃腸道和穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)。新型多糖鐵補(bǔ)鐵劑(PIC)，不僅穩(wěn)定性良好，在體內(nèi)釋放鐵后，多糖還具有多種生物活性。

蒲公英的花、葉、根中都含有多糖，其中根部多糖含量最高。據(jù)報道蒲公英多糖具有抗菌、抗氧化、等生理活性[5]，是優(yōu)良的多糖的提取材料。多糖易溶于熱水，不溶于乙醇等有機(jī)溶劑，因此本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法提取蒲公英根粗多糖，采用Sevag法除蛋白，獲得蒲公英精多糖；以蒲公英精多糖和氯化鐵為反應(yīng)物，在堿性條件下制備蒲公英多糖鐵，采用透析法精制。

多糖鐵的結(jié)構(gòu)研究表明，三價鐵(如FeCl3)在堿性條件下由于其內(nèi)在特性易形成羥基氧化鐵聚合鐵核，然后以聚合鐵核為結(jié)構(gòu)中心，穩(wěn)定地螯合一層多糖鏈，形成鐵核分子，外部再包裹一層親水性的鞘狀多糖鏈，圖1為多糖鐵結(jié)構(gòu)示意圖。

圖1 多糖鐵結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 試劑或材料

氯化鐵、檸檬酸三鈉、鹽酸羥胺、鄰二氮菲、醋酸鈉、無水乙醇、石油醚、硫氰酸鉀，以上試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒲公英根，吉林省長白山地區(qū)的野生蒲公英根；透析袋(截留分子質(zhì)量7000 D)，上海源葉生物科技有限公司。

1.3 儀器和表征方法

1.3.1 儀 器

HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市科析儀器有限公司；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；80-2臺式離心機(jī)，江蘇省金壇市科析儀器有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；98-1-C型數(shù)字控溫電熱套，天津市泰斯特儀器有限公司；RT2基本型加熱攪拌器，上海珂淮儀器有限公司；WD700 LG微波爐，天津樂金電器有限公司。

1.3.2 表征方法

紫外-可見分光光度法。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟/方法

1.4.1 蒲公英多糖的提取及精制

1.4.1.1 脫脂處理

稱取2 g干燥至恒重、粉碎、過60目篩的蒲公英根粉，用回流裝置和石油醚，脫脂處理1 h后，揮干溶劑。

1.4.1.2 粗多糖的提取

本步驟中，引導(dǎo)學(xué)生采用粗多糖的提取中常用的普通熱水提取法、微波輔助法、超聲波輔助法進(jìn)行探索。探索實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：

(1)普通熱水提取法：向干燥的蒲公英粉中加60 mL去離子水，80 ℃水浴浸提2 h，過濾，棄渣，取濾液。

(2)微波輔助法：微波分次處理干燥的蒲公英粉2 min (功率為420 W)，加60 mL去離子水，80 ℃水浴浸提2 h，過濾，棄渣，取濾液。

(3)超聲波輔助法：向干燥的蒲公英粉中加60 mL去離子水，超聲振蕩1 h(120 W，60 ℃)，過濾，棄渣，取濾液。

1.4.1.3 粗多糖的精制及得率計算

采用Sevag法除蛋白，具體操作如下：將蒲公英多糖溶液倒入分液漏斗中，加入其體積1/4的Sevag溶液(氯仿:正丁醇體積比為4:1)，劇烈振蕩、靜置，將渾濁的蛋白層從分液漏斗下口放出，重復(fù)操作直至沒有渾濁的蛋白層。將多糖液從分液漏斗上口倒入燒杯中，80 ℃加熱濃縮至約其體積1/3，冷卻，加入其體積3倍的無水乙醇，于4 ℃冰箱一夜。離心(3000 rpm，10 min)，取沉淀、干燥，獲得蒲公英精多糖，稱重并計算得率。

1.4.2 蒲公英多糖鐵的制備及精制

1.4.2.1 多糖鐵的制備

采用FeCl3共熱法制備蒲公英多糖鐵，具體操作如下：稱取0.2 g蒲公英精多糖和0.1 g檸檬酸三鈉置于三口燒瓶中，60 ℃加熱溶解。在磁力攪拌條件下緩慢滴加2 mol·L-1的FeCl3和20% NaOH(滴加速度比約1:2)，反應(yīng)過程中用精密pH試紙檢查反應(yīng)液的pH，控制pH為8，當(dāng)出現(xiàn)紅棕色沉淀時立即停止滴加，繼續(xù)反應(yīng)1 h。

本步驟中，引導(dǎo)學(xué)生對制備多糖鐵的不同條件如：溫度、pH進(jìn)行探索。

探索實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：

(1)反應(yīng)溫度分別設(shè)定為50、60、70 ℃，其他步驟同上。

(2)反應(yīng)液pH控制為7、8、9，其他步驟同上。

1.4.2.2 多糖鐵的精制

采用透析法精制。將上一步反應(yīng)液冷卻后倒入透析袋中，用去離子水透析，約4 h后換水，繼續(xù)透析一夜。

1.4.3 蒲公英多糖鐵中鐵含量的測定

1.4.3.1 蒲公英多糖鐵樣品溶液的配制及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將透析袋中的溶液離心，上清液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，透析袋用去離子水洗三次，洗液全部加入容量瓶中，定容。取5 mL樣品溶液，加1 mL 10%硫氰酸鉀，觀察溶液是否變?yōu)檠t色。

1.4.3.2 最佳吸收波長的確定

準(zhǔn)確移取10 μg·mL-1鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL于50 mL容量瓶中，加入1 mL 10% 鹽酸羥胺溶液，搖勻。放置2 min后，加5 mL 0.1 mol·L-1NaAc溶液和2 mL 0.15%鄰二氮菲溶液，定容，顯色30 min。配制10 μg·mL-1多糖鐵溶液，按同樣方法定容，顯色30 min。用1 cm比色皿，以空白試劑為參比液，在400～ 600 nm波長范圍內(nèi)對兩種溶液進(jìn)行掃描，確定λmax。

1.4.3.3 繪制鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算多糖鐵中的鐵含量

準(zhǔn)備7支50 mL容量瓶，1～6號分別加入0.00，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00 mL 鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液，7號加入5 mL多糖鐵樣品溶液，其后再分別加入鹽酸羥胺溶液，搖勻，放置2 min，再各加入5 mL NaAc溶液和2 mL 鄰二氮菲溶液，定容，顯色30 min，在λmax處，測定各溶液的吸光度A。

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖的提取

普通熱水提取法是通過擴(kuò)散作用將多糖從蒲公英根部組織內(nèi)溶解出來，由于細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到動態(tài)平衡需要較長時間，短時間內(nèi)多糖不能完全溶出，結(jié)合教學(xué)時數(shù)，將熱水浸提時間確定為2 h，精多糖得率為10.01%。

表1 不同方法提取的精多糖得率

微波輔助法中使用的微波能是一種能量形式[6]，它能使極性物質(zhì)組成的分子瞬時極化相互碰撞促進(jìn)反應(yīng)。在提取時間相同條件下，提取多糖時首先微波處理再熱水提取，得率為11.23%，與熱水浸提相比得率提高11.29%。

超聲波輔助提取法是利用超聲波的空化效應(yīng)將細(xì)胞壁震碎[7]。不僅縮短了提取時間，而且多糖得率為15.22%，比熱水提取法得率提高52.05%。

在此步驟中，還可以引導(dǎo)學(xué)生通過文獻(xiàn)的索引，了解其他的多糖提取方法，如酶解法[8]、微波-超聲聯(lián)合法等，拓展相關(guān)的知識面。

2.2 多糖鐵的制備

表2 不同條件制備的多糖鐵鐵含量

溫度較高時，多糖分子無規(guī)則運(yùn)動速率加快使反應(yīng)受阻；溫度較低時，多糖與Fe3+絡(luò)合速率降低。故選擇60 ℃為最佳反應(yīng)溫度。

反應(yīng)液pH對多糖鐵中鐵含量的影響較大。檸檬酸三鈉作為反應(yīng)的螯合劑[9]，水溶液呈弱堿性。pH為7時，其促絡(luò)合能力下降，F(xiàn)e3+不能與多糖完全結(jié)合；pH為9時，多糖的部分結(jié)構(gòu)可能被破壞，同時反應(yīng)液中離子強(qiáng)度增強(qiáng)，產(chǎn)生的陰離子與多糖分子的活性基團(tuán)發(fā)生競爭作用阻礙配合物的形成[10]。故選擇最佳反應(yīng)液pH為8。

在此步驟中，設(shè)置討論問題：除了本實(shí)驗(yàn)中探索的因素之外，還有哪些因素會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果？引導(dǎo)學(xué)生掌握確定最佳實(shí)驗(yàn)條件的方法，如單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)、響應(yīng)面試驗(yàn)等，進(jìn)一步拓展學(xué)生的知識面。

2.3 多糖鐵中鐵含量測定

2.3.1 繪制鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液和多糖鐵溶液的吸收光譜

比較鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液和多糖鐵溶液的吸收曲線，確定最佳吸收波長為510 nm。

圖2 鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液和多糖鐵溶液的吸收光譜

2.3.2 鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖3 鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在0～2.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，吸光度與濃度線性關(guān)系良好。

2.3.3 蒲公英多糖鐵中鐵含量的測定

表3 鐵含量測定結(jié)果

根據(jù)回歸方程，計算出7號溶液濃度為0.82 μg·mL-1，由稀釋比例可知，樣品溶液的鐵含量為8.2 μg·mL-1。

3 結(jié) 語

本綜合創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涵蓋到有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)、無機(jī)化學(xué)等領(lǐng)域，有助于提高學(xué)生綜合運(yùn)用知識的能力。將科研成果融合到實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，能夠開拓學(xué)生視野，提高實(shí)驗(yàn)興趣。在多糖提取、多糖鐵的制備中增加探索實(shí)驗(yàn)條件的環(huán)節(jié)，使整個教學(xué)過程充滿科學(xué)探究的樂趣。通過對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，激發(fā)探究問題、解決問題的積極性。該實(shí)驗(yàn)難度適中、內(nèi)容充實(shí)、現(xiàn)象穩(wěn)定、重復(fù)性好，適用于化學(xué)及其相關(guān)專業(yè)本科生綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)。