子宮頸鱗癌中MK、p63α的表達(dá)及臨床意義

方慧英，黃永平，李?lèi)?ài)霞

子宮頸鱗癌中MK、p63α的表達(dá)及臨床意義

方慧英，黃永平，李?lèi)?ài)霞

目的 探討MK、p63α在正常子宮頸鱗狀上皮和子宮頸鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)組織中的表達(dá)及其意義。方法 采用免疫組化SP法檢測(cè)30例正常子宮頸鱗狀上皮和98例子宮頸SCC組織中MK、p63α的表達(dá)，并分析兩者表達(dá)的相關(guān)性及與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 MK在正常子宮頸鱗狀上皮組織中幾乎不表達(dá)，在子宮頸SCC組織中的高表達(dá)率與低表達(dá)率分別為28.6%和38.8%；p63α在正常子宮頸鱗狀上皮組織中高表達(dá)率與低表達(dá)率分別為73.3%和16.7%，在子宮頸SCC組織中高表達(dá)率與低表達(dá)率分別為34.7%和45.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。p63α和MK在子宮頸SCC組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.372，P<0.01)；p63α和MK表達(dá)與患者年齡、腫瘤直徑和組織分化有相關(guān)性(P<0.05)，與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。MK高表達(dá)患者的生存期顯著低于陰性患者；p63α陰性患者生存率顯著低于高表達(dá)患者。結(jié)論 MK、p63α表達(dá)與子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)兩者有助于子宮頸癌預(yù)后的判斷。

子宮頸腫瘤；MK；p63α；免疫組織化學(xué)

子宮頸癌是全球常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年其發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)。子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多階段長(zhǎng)期作用的過(guò)程，鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)是子宮頸癌最主要的病理類(lèi)型，分析子宮頸SCC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，并對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，有助于提高患者的生存率和生存質(zhì)量。中期因子(midkine, MK)是一種肝素結(jié)合生長(zhǎng)和分化因子，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可能在腫瘤血管形成中起重要作用，國(guó)外有學(xué)者主張檢測(cè)MK作為惡性腫瘤的篩查和隨訪指標(biāo)[1-2]。p63也與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)[3]。本文采用免疫組化SP法檢測(cè)MK、p63α在正常子宮頸鱗狀上皮和子宮頸SCC組織的表達(dá)，探討兩者表達(dá)的相關(guān)性及與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科2008年1月～2011年3月收治的98例子宮頸SCC患者，年齡30～68歲，中位年齡45歲。依據(jù)1994年FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期59例，Ⅱ期39例，所有患者術(shù)前均未接受任何輔助治療且隨訪資料完整。另選取同期30例行全子宮切除的子宮肌瘤或子宮腺肌癥患者的正常子宮頸上皮組織，年齡25～62歲，中位年齡44歲，兩組間患者年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 試劑 抗原修復(fù)液、PBS緩沖液、DAB(ZLI-9049)顯色劑、蘇木精、中性樹(shù)脂、通用性二抗，均購(gòu)自北京中杉金橋公司。p63α鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，MK鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.3 方法 組織蠟塊2 μm厚連續(xù)切片，展鋪于玻片上干燥后，置于60 ℃恒溫烤箱烘烤12 h；切片常規(guī)脫蠟，置于pH 8.6的枸緣酸鈉溶液中高壓抗原修復(fù)，270 ℃煮沸，噴氣后計(jì)時(shí)2 min后立即關(guān)火，室溫下冷卻；自來(lái)水沖洗，置于3% H2O2溶液8 min，自來(lái)水沖洗，PBS溶液浸泡5 min；滴加一抗，4 ℃過(guò)夜，PBS沖洗；滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫下作用30 min，PBS沖洗；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封固。由三位病理醫(yī)師采用盲法對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，根據(jù)每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總上皮細(xì)胞數(shù)的百分比和染色深淺進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)判斷：陽(yáng)性細(xì)胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，深黃色或棕黃色為3分。兩項(xiàng)相乘采用半定量積分：0分為陰性，1～4分為低表達(dá)，>4分為高表達(dá)。

1.4 隨訪 采用電話、門(mén)診復(fù)查等方式隨訪，次數(shù)不限?；颊呱鏁r(shí)間以手術(shù)日始，截止日期為2016年7月，失訪5例，中位隨訪時(shí)間為48個(gè)月(6～102個(gè)月)，子宮頸癌死亡10例，其中Ⅰ期患者7例，Ⅱ期患者3例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各蛋白的表達(dá)水平與臨床病理特征間關(guān)系采用Mann-whitneyU檢驗(yàn)或Kruskal-wallis秩和檢驗(yàn)，各蛋白之間的相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，各蛋白表達(dá)對(duì)患者生存率的影響采用Kaplan-Meier法分析，生存率曲線的比較采用Log-rank檢驗(yàn)方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MK與p63α蛋白在正常子宮頸鱗狀上皮、SCC組織中的表達(dá) 正常子宮頸鱗狀上皮組織中MK幾乎不表達(dá)；MK在子宮頸SCC組織中主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，呈黃色或棕黃色，在子宮頸SCC組織中高表達(dá)率與低表達(dá)率分別為28.6%(28/98)、38.8%(38/98)；結(jié)果顯示子宮頸SCC組中MK的表達(dá)高于正常子宮頸鱗狀上皮組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1，圖1)。p63α主要表達(dá)在細(xì)胞核中，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀染色，在正常子宮頸鱗狀上皮組中高表達(dá)率與低表達(dá)率分別為73.3%(22/30)、16.7%(5/30)；在子宮頸SCC組中高表達(dá)率與低表達(dá)率分別為34.7%(34/98)和45.9%(45/98)；結(jié)果顯示p63α在子宮頸SCC組中的表達(dá)明顯低于正常子宮頸鱗狀上皮組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1，圖1)。

ABCD

圖1 MK和p63α在正常子宮頸鱗狀上皮及子宮頸SCC組織中的表達(dá)，SP法：A.MK高表達(dá)；B.p63α低表達(dá)；C.MK低表達(dá)；D.p63α高表達(dá)

2.2 子宮頸SCC組織中MK與p63α表達(dá)的相關(guān)性 在98例子宮頸SCC組織中，22.5%(22/98)的癌組織呈p63α高表達(dá)，MK陰性；23.5%(23/98)呈p63α和MK共同低表達(dá)；7.1%(7/98)呈p63α陰性、MK高表達(dá)；16.3%(16/98)呈p63α低表達(dá)、MK高表達(dá)，采用Spearman檢驗(yàn)p63α和MK的表達(dá)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為-0.372，兩者呈負(fù)相關(guān)(P<0.01，表2)。

2.3 p63α和MK蛋白表達(dá)與子宮頸SCC臨床病理特征相關(guān)性 子宮頸癌組織中p63α、MK表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、組織分化有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩種蛋白表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。

2.4 MK和p63α蛋白表達(dá)與子宮頸SCC患者預(yù)后的相關(guān)性分析 對(duì)98例子宮頸SCC患者進(jìn)行隨訪，其中失訪5例，死亡10例，5年生存率89.8%。子宮頸SCC患者中MK高表達(dá)患者病死率為28.6%(8/28)，低表達(dá)患者病死率為5.3%(2/38)，陰性患者病死率為0(0/32)。p63α高表達(dá)患者病死率為5.9%(2/34)，低表達(dá)患者病死率4.4%(2/45)，陰性患者病死率31.6%(6/19)。分別對(duì)MK和p63α進(jìn)行Log rank檢驗(yàn)，提示兩種蛋白的表達(dá)水平不同，生存率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.85、24.90，P<0.01，圖2)。

圖2 A.MK蛋白不同表達(dá)水平的Kaplan-Meier生存曲線；

分組nMK陰性低表達(dá)高表達(dá)χ2值P值p63α陰性低表達(dá)高表達(dá)χ2值P值正常子宮頸鱗狀上皮30254122．370．000?352211．160．001?子宮頸SCC98323828194534

*P<0.05

表2 子宮頸SCC組織中MK和p63α蛋白表達(dá)的相關(guān)性

*P<0.05

3 討論

MK是一種分泌型的堿性肝素結(jié)合蛋白，成熟的人MK蛋白相對(duì)分子質(zhì)量1.3×104，富含堿性氨基酸殘基和半胱氨酸殘基，MK能促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂和增殖、血管生成、增強(qiáng)纖溶酶原激活劑活性、誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，參與炎癥修復(fù)和腫瘤浸潤(rùn)，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和遷移[4-6]，其中，MK通過(guò)激活ER或PI3激酶途徑抑制Caspase 3激活，從而抑制細(xì)胞凋亡，MK還通過(guò)調(diào)節(jié)Akt、ERK1/2途徑促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。MK具有抗藥蛋白的作用，高表達(dá)MK的腫瘤細(xì)胞系對(duì)化療藥物的抵抗性明顯增強(qiáng)，并且這種抗性具有鄰近效應(yīng)，耐藥細(xì)胞通過(guò)分泌MK分子作用于其周?chē)乃幬锩舾屑?xì)胞，使腫瘤整體具有抗藥性[7-8]，MK在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，在很多惡性腫瘤中表達(dá)增強(qiáng)，包括Wilms瘤、胃癌、結(jié)直腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、前列腺癌、膀胱癌、肺癌等，高表達(dá)MK患者的預(yù)后相對(duì)于低表達(dá)患者差[9]，本實(shí)驗(yàn)中MK高表達(dá)的子宮頸SCC患者生存期顯著低于陰性者。

p63屬于p53家族成員，在各種上皮組織的發(fā)育、分化和形態(tài)中發(fā)揮重要作用。p63根據(jù)N端的剪切方式不同分為T(mén)Ap63和ΔNp63；根據(jù)C端的剪切方式不同，分為p63α、β、γ、δ、ε[3]，而在子宮頸癌等鱗狀上皮腫瘤中，以ΔNp63α亞型表達(dá)為主，其很可能是子宮頸SCC分化的敏感指標(biāo)之一，p63在子宮頸高分化SCC中高表達(dá)，而在中、低分化子宮頸SCC中表達(dá)顯著降低[10]。p63表達(dá)水平高的腫瘤患者預(yù)后相對(duì)較好[11]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮細(xì)胞獲得有效遷移能力的主要方式，ΔNp63α的喪失會(huì)導(dǎo)致EMT的發(fā)生，增加上皮細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。p63α在發(fā)生EMT的子宮頸癌組織中低表達(dá)，在未發(fā)生EMT的組織中表達(dá)水平相對(duì)較高，低表達(dá)ΔNp63α的患者發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性更高、預(yù)后也更差，過(guò)表達(dá)ΔNp63α能抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力[12]。本實(shí)驗(yàn)中p63α高表達(dá)的子宮頸SCC患者生存期顯著高于陰性者，提示p63α可作為判斷預(yù)后的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在子宮頸SCC中MK與p63α的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.372，P<0.01)，在子宮頸SCC組織中MK的表達(dá)高于正常子宮頸鱗狀上皮組，p63α在子宮頸SCC組織中的表達(dá)明顯低于正常子宮頸組織(P<0.01)。Moon等[13]發(fā)現(xiàn)子宮頸癌組織中MK的mRNA和蛋白的表達(dá)均高于正常對(duì)照組，且其程度與腫瘤大小、臨床分期有關(guān)，也有學(xué)者指出MK在子宮頸癌中高表達(dá)且與腫瘤分級(jí)相關(guān)[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，兩種蛋白的表達(dá)與組織分級(jí)、腫瘤大小和年齡顯著相關(guān)(P<0.05)，與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性，推測(cè)也可能是樣本量不足導(dǎo)致本組統(tǒng)計(jì)分析MK表達(dá)與子宮頸癌臨床分期無(wú)相關(guān)性。

鑒于MK與p63α均參與調(diào)控子宮頸癌的發(fā)展和預(yù)后，本組利用免疫組化SP法檢測(cè)兩者在子宮頸SCC中的表達(dá)，對(duì)其臨床病理特征和預(yù)后進(jìn)行分析，并進(jìn)一步探討兩者表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果顯示兩者呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)MK與p63α可能協(xié)同調(diào)節(jié)子宮頸癌的發(fā)展。因此，進(jìn)一步分析兩者的調(diào)控關(guān)系有助于闡明子宮頸癌的發(fā)展機(jī)制，為改善子宮頸癌的預(yù)后提供重要線索。

表3 MK、p63α與子宮頸SCC臨床病理特征的比較分析

*P<0.05

[1] 劉冬梅，吳永平，王慶苓. 干擾人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞MK表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增值、遷移及脈管形成的影響[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2015,31(7):729-733.

[2] Katsuki A, Sumida Y, Urakawa H,etal. Increased visceral fat and serum levels of triglyceride are associated with insulin resistance in Japanese metabolically obese, normal weight subjects with normal glucose tolerance[J]. Diabetes Care, 2003,26(8):2341-2344.

[3] Hashemi M, Jamshidian F, Shamei M H. Molecular focus in p63 and correlated human diseases[J]. J Paramed Sci, 2012,3(1):62-81.

[4] Huang H L, Shen J F, Min L S,etal. Inhibitory effect of midkine-binding peptide on tumor proliferation and migration[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(5):5387-5394.

[5] Chen S, Bu G, Takei Y,etal. Midkine and LDL-receptor-related protein 1 contribute to the anchorage-independent cell growth of cancer cells[J]. J Cell, 2007,120(22):4009-4015.

[6] Stoica G E, Kuo A, Powers C,etal. Midkine binds to anaplastic lymphoma kinase (ALK) and acts as a growth factor for different cell types[J]. J Biol Chem, 2002,277(39):35990-35998.

[7] Kang H C, Kim I J, Park J H,etal. Identification of genes with differential expression in acquired drug-resistant gastric cancer cells using high-density oligonucleotide microarrays[J]. Clin Cancer, 2004,10(1):272-284.

[8] Mirkin B L, Clark S, Zheng X,etal. Identification of midkine as a mediator for intercellular transfer of drug resistance[J]. Oncogene, 2005,24(31):4965-4974.

[9] Muramatsu T. MK, a heparin-binding cytokine with multiple roles in development, repair and diseases [J]. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci, 2010,86(4):410-425.

[10] 江文靜，胡衛(wèi)平，周 穎，等. 子宮頸癌中N-Cadherin、E-cadherin和p63的表達(dá)及相關(guān)性[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2012,28(11):1215-1223.

[11] Kola F, Kawakami S, Fujii Y,etal. Impaired p63 expression associates with poor prognosis and uroplakin Ⅲ expression in invasive urothelial carcinoma of the bladder[J]. Clin Cancer Res, 2003,9(15):5501-5507.

[12] Zhao W, Wang H, Han X,etal. ΔNp63α attenuates tumor aggressiveness by suppressing miR-205/ZEB1-mediated epithelial-mesenchymal transition in cervical squamous cell carcinoma[J]. Tumour Biol, 2016,37(8):10621-10632.

[13] Moon H S, Park W I, Sung S H,etal. Immunohistochemical and quantitative competitive PCR analyses of midkine and pleiotrophin expression in cervical cancer[J]. Gynecol Oncol, 2003,88(3):289-297.

[14] Choi S J, Song E S, Kim L,etal. Immunohistochemical analysis of Midkine expression in preinvasive and invasive squamous cell neoplasia of the uterine cervix[J]. Korean J Pathol, 2007,41(2):79-86.

安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究項(xiàng)目資助(KJ2015A375、KJ2016A249)、安徽省高校省級(jí)質(zhì)量工程項(xiàng)目(2016 jxtd044)

安徽人口職業(yè)學(xué)院護(hù)理系婦產(chǎn)科教研室，池州 247099

方慧英，女，碩士，副教授。E-mail：1749324992@qq.com

時(shí)間：2017-5-17 23:54 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.026.html

R 737.33

B

1001-7399(2017)05-0573-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.026

接受日期：2017-03-15