深低溫冷凍保存同種異體前交叉韌帶移植免疫研究*

張 培 劉 泉 周建生 朱 坤 趙 皓 項 平

1 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科,安徽省蚌埠市 233000; 2 組織移植安徽省重點實驗室

關(guān)節(jié)鏡下交叉韌帶重建是目前臨床治療交叉韌帶損傷常用的方法[1]，移植物的選擇臨床各異。同種異體前交叉韌帶(Anterior cruciate ligament，ACL)移植重建因免疫排斥反應(yīng)破壞了移植體的結(jié)構(gòu)，影響移植的療效，術(shù)后如何更好地抑制免疫排斥反應(yīng)仍是大家研究的課題。既往研究有相關(guān)方面報道[2]，然而異體韌帶移植后局部和全身反應(yīng)的機理報道較少，本課題從受體對移植物的免疫排斥反應(yīng)方面入手，采用深低溫冷凍保存同種異體大鼠ACL修復(fù)ACL損傷，對比分析局部與全身免疫的差異和水平，探索同種異體交叉韌帶移植后宿主對移植物的免疫反應(yīng)情況，進而為異體交叉韌帶移植后指導(dǎo)免疫抑制劑的合理應(yīng)用，提高臨床療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠60只，鼠齡6～8周，體質(zhì)量250～300g，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，通過蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，實驗過程中對動物處置嚴格遵守國家科學(xué)技術(shù)部2006年《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的要求。動物傳染病檢查雙后肢、膝關(guān)節(jié)X線骨科檢查正常。

1.2 動物分組 從60只大鼠中按照隨機數(shù)字表方法隨機選擇15只大鼠，切取30個后肢ACL標(biāo)本，再將30個ACL標(biāo)本按隨機數(shù)字表方法隨機分為冷凍保存組和常溫保存組，每組15個。余45只大鼠采用隨機數(shù)字表方法分三組，每組15只：A組采用正常自體移植物， B組采用冷凍保存的同種異體移植物，C組采用非冷凍保存異體組織移植物。

1.3 實驗方法

1.3.1 ACL的切取與保存。動物術(shù)前禁食、禁水8h，術(shù)前30min予阿托品0.5mg/kg肌注，采用3%戊巴比妥鈉1ml/kg行腹腔注射麻醉。麻醉生效后固定于手術(shù)臺上，手術(shù)嚴格按無菌要求操作，后肢雙側(cè)全膝關(guān)節(jié)剃毛，常規(guī)消毒、鋪巾。15只大鼠雙膝關(guān)節(jié)外側(cè)縱形切口，切開關(guān)節(jié)囊，將髕骨向內(nèi)側(cè)脫位，顯露并切取ACL。切取的30個ACL隨機分為冷凍保存組和常溫保存組。冷凍保存組15個標(biāo)本經(jīng)D-hank’s液漂洗后放入盛有1.5ml冷凍保護液(二甲基亞砜10%，DMEM 40%，小牛血清50%)的凍存管中，在4℃冰箱中平衡30min，移入-40℃冰箱，以0.5～1℃/min速度降至-40℃，維持2h，再投入-196℃液氮中保存2周。其余15個標(biāo)本常溫保存。

1.3.2 ACL的移植重建。ACL的切除：45只大鼠取右側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)外側(cè)長約1.0cm的縱切口，關(guān)節(jié)囊外側(cè)打開，使髕骨內(nèi)側(cè)脫位。在ACL止點處切除ACL，檢查前抽屜試驗及Lachman試驗陽性，術(shù)時注意保護關(guān)節(jié)面、關(guān)節(jié)軟骨、后交叉韌帶及髕下脂肪墊。

ACL的移植重建：大鼠右側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)屈曲100°，進行ACL的移植。A組：將切取的ACL再次植入，制作正常自體ACL移植重建模型。B組：將冷凍保存組的ACL凍存管置37℃水浴箱1min內(nèi)快速復(fù)溫解融，取出ACL用D-hank’s液漂洗3次，清除低溫保護劑。然后將ACL移植，制作冷凍保存同種異體移植組動物模型。C組：將常溫保存異體ACL植入，制作非冷凍保存異體組織移植。移植韌帶兩端用0號絲線縫合固定，檢查重建韌帶位置良好后，同時檢查前抽屜試驗及Lachman試驗陰性，以數(shù)碼相機拍攝移植后移植韌帶情況。關(guān)節(jié)內(nèi)稀碘伏沖洗后再用大量生理鹽水沖洗膝關(guān)節(jié)腔及傷口，縫合傷口，包扎。

1.3.3 術(shù)后處理。45只大鼠術(shù)后肌注1次青霉素(4×107U/L)1ml抗感染，待SD大鼠清醒后曲馬多(10mg/kg)止痛，分籠飼養(yǎng)，傷口消毒換藥，自由進食水。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 一般情況：觀察術(shù)后動物精神狀態(tài)、飲食及傷口愈合情況。

1.4.2 細胞免疫因子水平測定：在術(shù)后12、24、48h，每組隨機選擇5只大鼠，麻醉成功后抽取血液及手術(shù)側(cè)的關(guān)節(jié)液，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定關(guān)節(jié)局部組織液與血清中TNF-α、IL-2、IL-6水平。同時采用瑞氏染液染色，顯微鏡下觀察記錄關(guān)節(jié)局部組織液與血清中吞噬細胞功能檢測，計數(shù)測定不同時間點吞噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)變化[3]。吞噬率(%)=(吞噬有細菌的吞噬細胞數(shù))/(計數(shù)的100個吞噬細胞)×100%，吞噬指數(shù)=100個吞噬細胞所吞噬的細菌總數(shù)/計數(shù)的100個吞噬細胞。

1.4.3 組織學(xué)觀察：處死動物，取出移植韌帶，在顯微鏡下觀察韌帶色澤、彈性、滑膜包裹和血管浸潤情況，以及關(guān)節(jié)軟骨、半月板等結(jié)構(gòu)退變情況。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 術(shù)后0.5～1h，所有大鼠蘇醒，實驗動物均能夠自由覓食，體質(zhì)量變化比較差異無顯著性(P>0.05)。A、B組傷口均愈合良好，C組5例出現(xiàn)傷口紅腫，2例有少量感染滲出，均經(jīng)過換藥處理后愈合，實驗大鼠均無死亡。

2.2 大體及顯微組織學(xué)觀察 在每個觀察節(jié)點，A、B組移植韌帶光澤明亮，周圍出現(xiàn)極少量的未侵入組織內(nèi)的淋巴細胞，未發(fā)現(xiàn)組織壞死狀況，移植韌帶結(jié)構(gòu)清晰，膠原排列有序，彈性良好。C組移植韌帶光澤相對較暗，韌帶表面絮狀物附著，炎性細胞浸潤，韌帶彈性相對A、B組差。

2.3 細胞免疫因子測定

2.3.1 實驗動物血清TNF-α水平比較：在術(shù)后的每個觀察時間點，A組、B組TNF-α水平基本相同，差異無顯著性(P>0.05)，而每個觀察時間點，A組、B組TNF-α水平明顯高于C組(P<0.01)，見表1。實驗動物關(guān)節(jié)液中TNF-α水平比較：在術(shù)后的每個觀察時間點，A組、B組TNF-α水平基本相同，差異無顯著性(P>0.05)，而每個觀察時間點，A組、B組TNF-α水平明顯高于C組(術(shù)后12h時P<0.05，術(shù)后24h、48h時P<0.01)。在縱向比較發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)局部組織液中TNF-α水平增幅明顯高于血清中(P<0.01)。

表1 術(shù)后不同時間點各組大鼠血清、關(guān)節(jié)液TNF-α水平比較

注： A組、B組與同時間點C組比較，aP<0.05，bP<0.01。

2.3.2 實驗動物血清IL-2、IL-6水平比較：在術(shù)后每個觀察時間點，A組、B組IL-2、IL-6水平基本相同，差異無顯著性(P>0.05)，而每個觀察時間點，A組、B組IL-2、IL-6水平明顯高于C組(P<0.01)，見表2。

2.3.3 實驗動物關(guān)節(jié)液吞噬細胞吞噬率、吞噬指數(shù)比較：在術(shù)后每個觀察時間點，A組、B組吞噬細胞吞噬率、吞噬指數(shù)基本相同，差異無顯著性(P>0.05)，而每個觀察時間點，A組、B組吞噬細胞吞噬率、吞噬指數(shù)明顯高于C組(P<0．01)，見表3。

表2 術(shù)后不同時間點各組大鼠血清IL-2、IL-6水平比較

注：A組、B組與同時間點C組比較，aP<0.01。

表3 術(shù)后不同時間點各組大鼠關(guān)節(jié)液吞噬細胞吞噬率、吞噬指數(shù)

注：A組、B組與同時間點C組比較，aP<0.01。

3 討論

前交叉韌帶是膝關(guān)節(jié)重要的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，可以防止膝關(guān)節(jié)過伸、限制脛骨前移、控制脛骨旋轉(zhuǎn)和維持股骨與脛骨穩(wěn)定的對應(yīng)關(guān)系，當(dāng)ACL損傷時一般難以自行修復(fù)[2]，可引起不同程度的膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)及功能受限，如不及時處理將繼發(fā)膝關(guān)節(jié)半月板退行性變，引起創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[4]。

移植物的安全是前交叉韌帶重建成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5-6]，交叉韌帶重建以自體組織移植的效果較理想[7]，但其會出現(xiàn)供區(qū)損傷等并發(fā)癥，同時存在翻修術(shù)時移植物來源缺乏問題，因而常常無法滿足臨床需求。近年來同種異體交叉韌帶重建有所發(fā)展，并且是自體組織良好的替代物[8]，而移植后的免疫排斥反應(yīng)則會嚴重影響移植效果，因而如何降低并監(jiān)測異體移植物的免疫原性，抑制移植后排斥成為異體移植物重建前交叉韌帶成功的關(guān)鍵[9]，一般來說，為避免移植排斥反應(yīng)常采用深低溫冷凍處理移植物來消除抗原[10]，同時可以在術(shù)后應(yīng)用免疫抑制劑，由此在臨床上就需要考慮到如何應(yīng)用抑制劑及其劑量的調(diào)整、使用時間和應(yīng)用的效果的判斷。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后每個時間的觀察點，A組、B組移植物大體觀察相似，TNF-α、IL-2水平比較無差異(P>0．05)，C組低于A組、B組，差異有明顯的顯著性(P<0．05)，IL-2的主要生物學(xué)功能是促進T細胞的增殖與分化，這說明深低溫處理的異種移植物T細胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)明顯減弱，T 細胞活化明顯降低，表明引起較微弱的細胞免疫反應(yīng)，具有較小的免疫原性，所以引發(fā)的排斥反應(yīng)十分微弱，破壞性小，而未經(jīng)冷凍處理的移植物有明顯的抗原性，與既往學(xué)者研究結(jié)果相同[11]，本實驗中IL-2和TNF-α均同時得到增長，說明在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著協(xié)同增效作用。IL-6是通過激活效應(yīng)細胞或繼發(fā)性釋放其他細胞因子來直接或間接地實現(xiàn)免疫效應(yīng)，本實驗中IL-2與IL-6出現(xiàn)同步升高，一定程度上說明在免疫應(yīng)答中起到相互協(xié)同作用。

新鮮異體移植物的免疫反應(yīng)強烈，經(jīng)冷凍處理可滅活、破壞活細胞，降解移植物供體細胞表面的抗原結(jié)構(gòu)，從而減輕免疫反應(yīng)。吞噬細胞包括外周血中的中性粒細胞和單核細胞以及多種器官、組織中的巨噬細胞，在免疫應(yīng)答、效應(yīng)及調(diào)節(jié)過程中起重要作用。本實驗結(jié)果顯示，C組吞噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù)明顯低于A組、B組，表明C組免疫細胞因子的水平明顯降低，更加抑制機體體液免疫反應(yīng)。A組、B組比較差異無顯著性，表明深低溫處理后可以有效預(yù)防細胞免疫因子的抑制，同時A組、B組植入物周邊僅存在少量淋巴細胞浸潤，未發(fā)現(xiàn)組織壞死現(xiàn)象。而C組移植物遭到破壞，局部淋巴細胞浸潤明顯，引起免疫排斥反應(yīng)，由此冷凍處理可以明顯改變肌腱細胞表面的抗原性，同時局部免疫較全身免疫反應(yīng)較快，說明局部的免疫指標(biāo)可以更好地反應(yīng)關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)，進而指導(dǎo)臨床用藥。

異體移植物的轉(zhuǎn)歸對于ACL重建后的生物學(xué)功能有著重要的作用，因ACL的轉(zhuǎn)歸是影響移植物轉(zhuǎn)歸的重要因素，移植物的轉(zhuǎn)歸受諸多因素的影響，諸如骨隧道內(nèi)不同填充物的介入[12]、不適當(dāng)?shù)目祻?fù)計劃[13]、手術(shù)時機的選擇[14]，另外解剖重建與等長重建[15]、交叉韌帶殘端的保留情況[16]，由此促進移植物的轉(zhuǎn)歸研究各異，同種異體移植物的處理方法、移植的手術(shù)方法、來源等是影響移植物轉(zhuǎn)歸主要原因[17]。經(jīng)過冷凍處理的同種異體移植韌帶可以避免供區(qū)疼痛、感染等并發(fā)癥，相對自體肌腱移植患者疼痛以及關(guān)節(jié)僵硬概率更小，所以冷凍處理同種異體肌腱移植為大多數(shù)術(shù)者及患者接受[18]，本實驗采用兩步冷凍保存同種異體ACL重建，對比研究證實深低溫冷凍保存能夠很好地清除異體ACL表面抗原，最大限度減輕免疫排斥反應(yīng)，促進移植物的轉(zhuǎn)歸，這與既往學(xué)者研究結(jié)果相同[19]。

綜上所述，深低溫冷凍保存能夠很好地減輕免疫排斥反應(yīng)，其局部較全身的免疫排斥反應(yīng)相對較明顯，進而為臨床更早、更有效地觀察移植后免疫排斥情況開辟新的途徑，更有利于免疫抑制劑的合理應(yīng)用，然而細菌、病毒可能是潛在的傳染源[20]，并且遠期反應(yīng)尚需要進一步研究。