星形膠質(zhì)細(xì)胞在帕金森大鼠中的作用機(jī)制研究

李承家， 秦麗紅， 李承澤， 龔張鋆， 陳 洋， 王 辰

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見于中老年的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)-紋狀體多巴胺能通路變性。黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元死亡，多巴胺分泌減少是帕金森病的一個(gè)重要病理特征。星形膠質(zhì)細(xì)胞是膠質(zhì)細(xì)胞的一種，是腦內(nèi)最廣泛的一類細(xì)胞。它們伸展充填在神經(jīng)細(xì)胞的胞體及其突起之間，起支持、保護(hù)和分隔神經(jīng)細(xì)胞的作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞在大腦中還有許多更加重要復(fù)雜的功能。而目前研究表明[1,2],星形膠質(zhì)細(xì)胞在PD病變過程中發(fā)揮著重要作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取由佳木斯大學(xué)動(dòng)物中心提供健康雄性SD大鼠130只，月齡2.5～3 m，體重210～240 g，健康情況良好，用于PD大鼠模型100只，其中50只移入2型星形膠質(zhì)細(xì)胞(type 2 Astroyts T2As)為PD+T2As組，余50只PD大鼠注射等量的生理鹽水于紋狀體為PD組；正常大鼠30只，注射等量的生理鹽水于正常SD大鼠紋狀體中，為對(duì)照組。

1.2 帕金森病大鼠模型的制備 給予SD大鼠腹腔注射4%的水合氯醛，麻醉后,固定于立體定向儀。使十字點(diǎn)前囟和人字點(diǎn)后囟相平，當(dāng)門齒桿位置低于水平0度時(shí)，則顱骨水平位達(dá)成。在顱骨表面注藥點(diǎn)處鉆1個(gè)約2 mm的小孔。分別在以下兩點(diǎn)處各注入10 μg/5 μl含0.2%抗壞血酸的6-OHDA鹽溶液。第一點(diǎn):前囟前1 mm，中線右側(cè)3.0 mm，硬膜下5 mm；第二點(diǎn)：前囟后0.2 mm，中線右側(cè)+2.6 mm，硬膜下6.0 mm。速度為1 μg/min，注射后留置4 min退出，縫合皮膚，碘酒擦拭縫合處。每天腹腔給予20萬U青霉素，共7 d以預(yù)防感染。模型建立2 w后，用阿樸嗎啡(apomnphine，APO)誘發(fā)旋轉(zhuǎn)，選210轉(zhuǎn)/30 min以上的動(dòng)物為成功PD模型。對(duì)照組以生理鹽水代替6-OHDA鹽溶液,其余步驟與模型制作組相同。

1.3 T2As的分離純化及移植 取大腦皮質(zhì)分散，用0.125%的胰酶消化7 min(37 ℃)，加含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止胰酶的消化作用，吸管反復(fù)吹打至細(xì)胞分散，得到單細(xì)胞懸液。以 3×105/cm2的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中孵育30 min，以去除成纖維細(xì)胞。吸出細(xì)胞懸液，再接種于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集未貼壁的O-2A祖細(xì)胞用篩網(wǎng)過濾，濾液經(jīng)1000 rpm離心5 min，倒掉上清液，細(xì)胞因子培養(yǎng)液重懸后接種于PLL包被的六孔培養(yǎng)板中。將分離純化的O-2A祖細(xì)胞放于含20%FCS 的培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d，即可分化為T2As。將分離純化的T2As移植入PD大鼠的患側(cè)紋狀體，步驟與模型制作組相同。

1.4 單胺類遞質(zhì)含量的測(cè)定 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每周分別隨機(jī)選擇10只大鼠，行單胺類遞質(zhì)含量的測(cè)定取大鼠紋狀體，液氮冷凍后存于-80 ℃冰箱。樣品處理：紋狀體組織準(zhǔn)確稱重，按照1∶10的比例加人0.4 mol/L高氯酸，除去蛋白，高速冷凍離心機(jī)12000 r/min 4 ℃ 離心15 min。取上清，再置于12000 r/min 4 ℃ 離心20 min。取上清液加樣行，應(yīng)用高效液相色譜-電化學(xué)法測(cè)定各組大鼠紋狀體內(nèi)多巴胺含量，檢測(cè)各樣品的多巴胺(DA)，DA的代謝產(chǎn)物3,4二羥基苯乙酸(DOPAC)和高香芳酸(HVA)的含量。用外標(biāo)法定量，以峰面積表示其含量。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠旋轉(zhuǎn)行為的旋轉(zhuǎn)速度、維持時(shí)間測(cè)定 注射APO后誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為表現(xiàn)為：頭部和軀干彎向健側(cè)(左側(cè))旋轉(zhuǎn)，伴有震顫、咬尾足、尾部僵直等異常行為。健康對(duì)照組無旋轉(zhuǎn)行為。PD組出現(xiàn)明顯的旋轉(zhuǎn)行為，各周均數(shù)采用Bonfferonit檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)術(shù)后4 w達(dá)到較高水平，與第2周、第3周相比升高明顯(P<0.01)，PD+T2As組在第4～6周，與PD組比較旋轉(zhuǎn)速度明顯降低(P<0.01)(見表1)，大鼠維持旋轉(zhuǎn)行為的時(shí)間叫維持時(shí)間。PD組旋轉(zhuǎn)時(shí)間逐漸升高，到第4周后趨于穩(wěn)定，PD+T2As組在第4～6周，與PD組比較旋轉(zhuǎn)速度明顯降低(P<0.01)(見表2)。

2.2 大鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(DA、DOPAC、HVA)的含量變化 健康對(duì)照組單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(DA、DOPAC、HVA)各周比較均無明顯差別(P>0.05)，PD組與對(duì)照組比較單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(DA、DOPAC、HVA)明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，移植T2As后，DA、DOPAC、HVA含量逐漸升高，在第4周開始與第2周相比具有明顯區(qū)別(P<0.01)。在第3周開始均明顯高于PD組(P<0.01)(見表3～表5)。

表1 大鼠每周的旋轉(zhuǎn)速度轉(zhuǎn)/分)

與PD組比較*P>0.05;與PD組比較#P<0.01

表2 大鼠旋轉(zhuǎn)行為的維持時(shí)間

與PD組比較*P>0.05;與PD組比較#P<0.01

表3 大鼠紋狀體部位的DA含量變化

與對(duì)照組比較◇P<0.01;與PD組比較*P>0.05;與PD組比較#P<0.01;與同組第2周、第3周比較均△P<0.01

表4 大鼠紋狀體部位的DOPAC含量變化

與對(duì)照組比較◇P<0.01;與PD組比較*P>0.05;與PD組比較#P<0.01;與同組第2周、第3周比較△P<0.01

表5 大鼠紋狀體部位的HVA含量的變化

與對(duì)照組比較◇P<0.01;與PD組比較*P>0.05;與PD組比較#P<0.01;與同組第2周比較△P<0.01

3 討 論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的發(fā)育過程中,星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,As)始終伴隨著其發(fā)育過程,不僅能起到支持和隔離的作用,還能起到調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外離子濃度、攝取、供給及滅活神經(jīng)遞質(zhì)、傳遞第二信使等功能。近年來,有報(bào)道[3,4]星形膠質(zhì)細(xì)胞能分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子及釋放可溶性分子，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元，對(duì)神經(jīng)損傷具有清除作用。本實(shí)驗(yàn)通過建立PD大鼠模型后將2型星形膠質(zhì)細(xì)胞移植到PD大鼠紋狀體內(nèi)，觀測(cè)3組大鼠(PD+T2As組、PD組、對(duì)照組)行為學(xué)改變(啟動(dòng)時(shí)間、旋轉(zhuǎn)速度和維持時(shí)間)，同時(shí)觀察單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(DA、DOPAC、HVA)在紋狀體中的變化，以期探究2型星形膠質(zhì)細(xì)胞在PD大鼠中的作用。

應(yīng)用6-OHDA建立大鼠PD模型的方法，有黑質(zhì)內(nèi)注射法、內(nèi)側(cè)前腦束注射法和紋狀體內(nèi)注射法。紋狀體較黑質(zhì)體積大，注藥準(zhǔn)確性高，模型更穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)采取兩點(diǎn)紋狀體內(nèi)注射法，同時(shí)損毀尾殼核和蒼白球外側(cè)段，損傷更完全，6-OHDA注入紋狀體后，可被多巴胺能神經(jīng)末梢攝取，逆行性損毀黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元。此過程是漸進(jìn)性的，可以模擬PD的發(fā)病過程。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見3組大鼠的旋轉(zhuǎn)速度、維持時(shí)間具有明顯區(qū)別，對(duì)照組明顯優(yōu)于PD組和PD+T2As組，PD+T2As組從第4周開始較PD組有顯著改善；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(DA、DOPAC、HVA)在紋狀體中的含量在3組中的測(cè)定，結(jié)果提示從第3周開始PD+T2As組顯著高于PD組，PD組和PD+T2As組單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量在第2～6周均低于正常對(duì)照組。說明T2As對(duì)損傷的黑質(zhì)-紋狀體通路具有修復(fù)和一定的保護(hù)作用，對(duì)PD損傷側(cè)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞具有延緩死亡、增加黑質(zhì)-紋狀體DA的合成及釋放，減慢DA分解速度，可能在一定程度保護(hù)了損壞的DA能神經(jīng)細(xì)胞。

神經(jīng)組織由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成。在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，星形細(xì)胞數(shù)量最多,分布最廣。星形細(xì)胞廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的灰質(zhì)和白質(zhì)，具有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的大部分功能，如：支持、修復(fù)與再生、吞噬與保護(hù)、運(yùn)輸營養(yǎng)、參與構(gòu)成血腦屏障、攝取化學(xué)遞質(zhì)和分泌功能等。星形膠質(zhì)細(xì)胞支持、引導(dǎo)神經(jīng)元，并增強(qiáng)神經(jīng)元的存活，促進(jìn)神經(jīng)元之間形成突觸連接。星形細(xì)胞又可分為T1As和T2As兩種。在LPS(一種位于革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁最外層的類脂多糖類物質(zhì)，可刺激炎癥反應(yīng)發(fā)生)的刺激下，他們觀察到靜息星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)門1As，后者可以產(chǎn)生大量的炎癥因子。另一方面，T2As可由缺氧所誘導(dǎo)，在卒中腦組織附近分泌支持神經(jīng)元生長，保證神經(jīng)元健康及存活的物質(zhì)。星形膠質(zhì)細(xì)胞具有合成和分泌多種細(xì)胞因子的功能,包括可擴(kuò)散的神經(jīng)營養(yǎng)因子和非擴(kuò)散的神經(jīng)元支持物質(zhì),具有長期營養(yǎng)神經(jīng)元、短暫刺激軸突生長等作用。分泌的腦源性生長因子、纖維粘連蛋白、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,BFGF)、層粘連蛋白、一氧化氮(NO)、膠質(zhì)細(xì)胞源性生長因子等，雖然具體保護(hù)的分子機(jī)制不清楚，但這些營養(yǎng)因子能夠使DA能神經(jīng)元減少神經(jīng)毒性物質(zhì)的損傷，對(duì)DA能神經(jīng)元的營養(yǎng)、再生和分化的重要作用已在大量實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。

近年來，許多研究自由基生成和氧化應(yīng)激促進(jìn)了PD的發(fā)展，DA自身氧化可產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物H2O2，與鐵作用后產(chǎn)生具有高毒性自由基，研究顯示PD患者黑質(zhì)部分的過氧化物含量較多，受此氧自由基的影響變性的核酸及蛋白變性的數(shù)量明顯高于健康組，推測(cè)DA能神經(jīng)元暴露于大量活性氧致使DA能神經(jīng)元選擇性丟失，而星形膠質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生谷胱甘肽過氧化物酶，它的作用可以阻止過氧化氫轉(zhuǎn)化為高毒性的羥自由基來達(dá)到抗氧化應(yīng)激而發(fā)揮重要神經(jīng)保護(hù)作用，這種保護(hù)作用對(duì)易受氧化應(yīng)激的黑質(zhì)DA能神經(jīng)元來說尤為重要。研究顯示[5,6]晚期PD大鼠黑質(zhì)部分含谷胱甘肽過氧化物酶陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞密度顯著低于健康對(duì)照組，體外培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞的過程中也發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞可以保護(hù)神經(jīng)元免受過氧化物誘導(dǎo)損傷。其作用機(jī)制可能是通過ATP依賴轉(zhuǎn)運(yùn)體，NMDA受體所介導(dǎo)。所以推測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激機(jī)制參與PD神經(jīng)保護(hù)作用。此外，在DA能神經(jīng)元附近，DA自身氧化代謝產(chǎn)生的毒性氧自由基會(huì)對(duì)DA能神經(jīng)元造成損傷，星型膠質(zhì)細(xì)胞其表達(dá)的單胺氧化酶B(MAO-B)和兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)對(duì)DA的作用代謝而保護(hù)仍舊存活的神經(jīng)元，星型膠質(zhì)細(xì)胞還可以大量攝取細(xì)胞外的興奮氨基酸減少其對(duì)黑質(zhì)的毒性作用以起到保護(hù)神經(jīng)元的目的[7]。但是，星形膠質(zhì)細(xì)胞在某些刺激因素的作用下也可能通過釋放一些促炎癥因子[8,9]，如一氧化氮、腫瘤壞死因子-α等炎性因子對(duì)多巴胺能神經(jīng)元造成損傷而推動(dòng)帕金森病的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)移植星形膠質(zhì)細(xì)胞后的PD大鼠一段時(shí)間后行為學(xué)明顯改善，腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量上調(diào)明顯，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞在PD的早期階段，在一定程度保護(hù)了黑質(zhì)-紋狀體中受損的DA能神經(jīng)細(xì)胞，保護(hù)作用是占主導(dǎo)作用。但星形膠質(zhì)細(xì)胞在顱內(nèi)后期分泌的神經(jīng)遞質(zhì)，以及是否可以定向分化為具有其他生理學(xué)的神經(jīng)元，這些對(duì)DA能神經(jīng)元的具體作用仍不清楚，所以，我們進(jìn)一步研究PD的不同時(shí)期星形膠質(zhì)細(xì)胞的確切作用機(jī)制，對(duì)于治療帕金森病有著重要的意義。