右美托咪定調(diào)節(jié)MAPK/ERK-CREB通路對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的保護作用

朱建坡， 梁 冰

神經(jīng)系統(tǒng)疾病常發(fā)生于中樞神經(jīng)、周圍神經(jīng)、植物神經(jīng)系統(tǒng)，主要以運動、感覺和植物神經(jīng)功能障礙為主要癥狀的疾病[1,2]。研究表明，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路與神經(jīng)系統(tǒng)性疾病密切相關(guān)，抑制MAPK信號通路可以減少海馬神經(jīng)元損傷和凋亡[3,4]。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一種α-2腎上腺素能受體激動劑，研究表明，DEX可減輕大鼠慢性神經(jīng)病理性疼痛，抑制MAPK、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(phosphoryltion of extracellular regulatory protein kinases，pERK)、磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphoryltion of cAMP response element binding protein，pCREB)表達，推斷DEX通過調(diào)控MAPK/ERK-CREB通路對海馬神經(jīng)元凋亡起保護作用[5]。本實驗通過對大鼠構(gòu)建癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)模型機構(gòu)建立一種神經(jīng)系統(tǒng)疾患，觀察DEX對SE大鼠行為及MAPK/ERK-CREB通路的影響，以初步探究DEX對SE大鼠海馬神經(jīng)元凋亡保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康Sprague-Dawley SPF級雄性大鼠40只，6～8周齡，體重200 g左右，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供，動物許可證號:2016PS260K。飼養(yǎng)條件：溫度(22±2)℃，濕度40%～70%，每籠5只，自由攝食飲水，常規(guī)飼養(yǎng)1 w進行實驗。本研究對于大鼠處理均符合實驗動物福利與倫理委員會原則。

1.2 試劑及儀器 DEX(國藥準字H20090248)購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；Nissl染色試劑盒(貨號：WLA128)購自萬類生物有限公司，TUNEL試劑盒(貨號：C1086)購自碧云天生物技術(shù)研究所；GAPDH抗體(貨號：ab181602)、p-ERK抗體(貨號：ab79483)、p-CREB抗體(貨號：ab220798)、caspase-3抗體(貨號：ab13847)、Bax抗體(貨號：ab32509)、Bcl-2抗體(貨號：ab182858)均購自美國Abcam公司；毛果蕓香堿(貨號：MB5259)購自美侖生物有限公司；氯化鋰(貨號：L1110)、阿托品(貨號：AT100)購自美國Spectrum公司；地西泮(貨號：BZ2886)購自上海恪敏生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的二抗(貨號：BHR101)購自北京博爾西科技有限公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒(貨號：P0010S)購自上海碧云天公司；蛋白電泳及電轉(zhuǎn)移裝置(型號：AU5800)購自北京市六一儀器廠；酶聯(lián)免疫分析儀(型號：EVO75)購自澳大利亞Techan公司；超低溫冰箱(型號：MDF-U32V)購自美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠SE模型構(gòu)建[6]及分組 大鼠SE模型構(gòu)建：大鼠腹腔注射3 mmol/kg 氯化鋰，24 h后同一部位注射50 mg/kg毛果蕓香堿，觀察大鼠行為，根據(jù)癲癇發(fā)作Racine分級進行判斷，大于4級，表明癲癇模型點燃成功。發(fā)作持續(xù)15 min后腹腔注射1 mg/kg阿托品，40 min后給予10 mg/kg地西泮腹腔注射直至發(fā)作終止從而進行控制。將大鼠隨機分為正常對照組、陽性對照組、SE組、SE+DEX組，每組各10只。SE模型構(gòu)建成功后，SE+DEX組大鼠腹腔注射1 μmol/L DEX；SE組、正常對照組腹腔注射同量0.9%氯化鈉液；陽性對照組大鼠腹腔注射1 μmol/L苯巴比妥，藥物干預(yù)24 h后留取標本。根據(jù)改良后Racine分級[7]：正常狀態(tài)，0級；出現(xiàn)雙目緊閉，面部細纖維肌束發(fā)生顫動(如耳朵和胡須等部位)，伴隨吸氣動作,1級；出現(xiàn)點頭頻率，面部肌束顫動明顯,2級；前肢單肢發(fā)生抽搐,3級;前肢均發(fā)生陣攣，身體無直立,3.5級；前肢均發(fā)生陣攣，身體直立，4級；身體強直，伴隨肢體倒向一側(cè)，4.5級；出現(xiàn)強直陣攣，身體直立且背部倒地，5級。

1.3.2 動物行為學(xué)觀察 給藥后，對所有大鼠按Racine評分標準分別進行評分，每20 min作為一個評分時間點，連續(xù)觀測，監(jiān)測120 min，記錄并計算各組大鼠Racine評分。

1.3.3 樣品采集 給藥24 h后，每組隨機抽取5只腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，采用20 ml生理鹽水和4%多聚甲醛40 ml經(jīng)心臟灌注，取腦后采用4%多聚甲醛浸泡過夜，大腦標本在4%多聚甲醛固定24 h進行常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，制備海馬組織蠟塊置于4 ℃冰箱保存。用石蠟切片機作冠狀切面連續(xù)切片，切片厚度約為4 μm，主要用于Nissl法和TUNEL法檢測。另將每組剩余5只大鼠常規(guī)麻醉后，迅速斷頭取腦組織，在4 ℃條件下鈍性分離大鼠雙側(cè)海馬組織，迅速置于液氮罐中保存，用于Western blot檢測。

1.3.4 Nissl法檢測細胞損傷 將1.3.3中制備石蠟切片于二甲苯、不同濃度乙醇中浸泡，1%甲苯胺藍染色40 min，后分色，脫水至透明后，封片，最后于顯微鏡下觀察并對尼氏陽性的細胞進行計數(shù)。

1.3.5 TUNEL法檢測細胞凋亡 將1.3.3中制備的石蠟切片于二甲苯、不同濃度乙醇中浸泡5 min后，用蛋白酶K室溫消化1 h后，按TUNEL試劑盒說明書將切片進行染色、終止反應(yīng)、封片等，于熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡數(shù)目。經(jīng)TUNEL染色的陽性細胞呈棕黃色或棕褐色。

1.3.6 Western blot法檢測大鼠海馬組織中MAPK/ERK-CREB通路相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白表達 從液氮罐中取出海馬組織，然后按照1∶5(wt/vol)加入500 μl細胞裂解液用玻璃研磨器研磨海馬組織，裂解30 min后提取組織蛋白，離心取上清液即總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度后，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后加入一抗(MAPK、pERK、pCREB、caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH抗體，1∶1500)，4 ℃孵育過夜，次日洗膜后加二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，TBST洗膜，加ECL發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的行為學(xué)觀察 與正常對照組相比，SE、陽性對照組、SE+DEX組大鼠Racine分值顯著增加(P<0.05)，與SE組相比，陽性對照組、SE+DEX組大鼠Racine分值顯著降低(P<0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠Racine分值

與正常對照組比較*P<0.05；與SE組比較#P<0.05

2.2 各組大鼠海馬神經(jīng)元損傷及凋亡情況

2.2.1 細胞損傷結(jié)果 正常對照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元邊緣清晰，排列整齊，胞漿中可見尼氏小體；SE組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元缺失嚴重、排列松散，胞漿深淺不一，核仁消失或不明顯；陽性對照組、SE+DEX組，神經(jīng)元缺失減少，排列較規(guī)律(見圖1)。對大鼠海馬神經(jīng)元計數(shù)分析結(jié)果顯示，與正常對照組相比，SE組、陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)顯著減少(P<0.05)；與SE組相比，陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)顯著增加(P<0.05)(見表2)。

2.2.2 細胞凋亡結(jié)果 SE組、陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)椎體細胞固縮。TUNEL陽性細胞計數(shù)分析結(jié)果顯示，與正常對照組相比，SE、陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬區(qū)棕褐色陽性細胞顯著增加(P<0.05);與SE組相比，陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬區(qū)棕褐色陽性細胞顯著減少(P<0.05)(見圖2、表3)。

2.3 各組大鼠海馬組織中MAPK/ERK-CREB通路相關(guān)蛋白表達結(jié)果比較 與正常對照組相比，SE、陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬組織中MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；與SE組相比，陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬組織中MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白表達量顯著降低(P<0.05)(見圖3、表4)。

2.4 各組大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白表達結(jié)果比較 與正常對照組相比，SE、陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬組織中caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；與SE組相比，陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬組織中caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)(見圖4、表5)。

組別例數(shù)海馬神經(jīng)元數(shù)量(個)正常對照組SE組陽性對照組SE+DEX組5555145.32±5.1262.14±4.01*73.12±4.12*#76.45±3.98*#

與正常對照組比較*P<0.05；與SE組比較#P<0.05

組別例數(shù)海馬區(qū)凋亡細胞數(shù)量(個)正常對照組SE組陽性對照組SE+DEX組55551.32±0.0215.32±1.13*12.24±1.10*#11.86±1.08*#

與正常對照組比較*P<0.05；與SE組比較#P<0.05

表4 各組大鼠海馬組織中MAPK/ERK-CREB通路相關(guān)蛋白表達結(jié)果

與正常對照組比較*P<0.05；與SE組比較#P<0.05

表5 各組大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白表達結(jié)果

與正常對照組比較*P<0.05；與SE組比較#P<0.05

a：正常對照組；b：SE組；c：陽性對照組；d：SE+DEX組

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元Nissl染色圖

a：正常對照組；b：SE組；c：陽性對照組；d：SE+DEX組

a：正常對照組；b：SE組；c：陽性對照組；d：SE+DEX組

圖3 各組大鼠海馬組織中p-ERK、p-CREB蛋白表達圖

a：正常對照組；b：SE組；c：陽性對照組；d：SE+DEX組

圖4 各組大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白表達圖

3 討 論

神經(jīng)性疾病發(fā)生會引起患者癱瘓、共濟失調(diào)、肌萎縮側(cè)索硬化、頭痛、反射異常、肌萎縮、排尿、排糞、性功能障礙等癥狀。SE屬于神經(jīng)性疾病，是由多種病因共同引起的一種慢性腦部疾病[8]。隨著社會發(fā)展、飲食習(xí)慣變化，神經(jīng)性疾病的發(fā)病率逐年升高，嚴重影響人們的身體健康和生活質(zhì)量[9]。臨床上對于神經(jīng)性疾病治療，多以藥物控制為主，但目前藥物對智力、運動功能、情緒等方面造成嚴重的副作用，因此找尋找新的藥物對神經(jīng)性疾病的治療具有重要意義。DEX主要是作用于中樞神經(jīng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)，有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抑制交感神經(jīng)活動等作用，臨床多與鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛藥物聯(lián)合使用進行麻醉[10]，最近有研究表明DEX對SE有良好的治療作用[11]。本研究通過觀察各組大鼠的行為學(xué)發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，SE、陽性對照組、SE+DEX組大鼠Racine分值顯著增加；與SE組相比，陽性對照組、SE+DEX組大鼠Racine分值顯著降低，提示SE大鼠模型構(gòu)建成功，DEX對SE大鼠有一定治療作用。SE是一種以中樞神經(jīng)功能障礙為特征的腦部疾病，由于海馬區(qū)的腦神經(jīng)元過度興奮，持續(xù)頻繁的興奮會造成腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)等化學(xué)物質(zhì)發(fā)生病變所引起的。丁秀芳等[12]研究發(fā)現(xiàn)，SE可導(dǎo)致海馬區(qū)神經(jīng)元損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，SE組、陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元缺失嚴重，核仁消失或不明顯，神經(jīng)椎體細胞固縮，大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)顯著減少，海馬區(qū)棕褐色陽性細胞顯著增加，提示SE發(fā)生會引起海馬神經(jīng)元數(shù)減少，海馬神經(jīng)元凋亡增加。研究表明，DEX可以抑制海馬神經(jīng)元損傷[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與SE組相比，陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)顯著增加，海馬區(qū)棕褐色陽性細胞顯著減少，提示DEX可以抑制海馬神經(jīng)元數(shù)減少和海馬神經(jīng)元凋亡。

caspase-3是一種剪切酶，在細胞凋亡中不可缺失，Bax屬于Bcl-2家族，是凋亡促進基因，Bcl-2是抗凋亡基因，Bax可以與Bcl-2形成二聚體結(jié)構(gòu)[14]。早期研究發(fā)現(xiàn)，Bax/Bcl-2比例可以表明細胞凋亡的強弱，本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，SE、陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬組織中caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2蛋白表達量顯著升高，Bcl-2蛋白表達量顯著降低，提示caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達與細胞凋亡密切相關(guān)。研究表明，降低海馬區(qū)Bax、caspase-3表達，提高Bcl-2表達，DEX可以抑制AD大鼠海馬區(qū)內(nèi)細胞凋亡[15,16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與SE組相比，陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬組織中caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2蛋白表達量顯著降低，Bcl-2蛋白表達量顯著升高，提示DEX可能通過抑制caspase-3、Bax表達，促進Bcl-2蛋白表達，抑制細胞凋亡。

MAPK家族主要作用是將細胞外信號傳導(dǎo)到細胞內(nèi)部與ERK1/2在腦部海馬區(qū)發(fā)揮重要作用[17]。ERK通路可以激活CREB使其發(fā)生磷酸化，調(diào)控神經(jīng)元發(fā)育、興奮、凋亡等過程[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，SE、陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬組織中MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白表達量顯著升高，提示MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白表達與SE發(fā)生密切相關(guān)。研究表明，抑制MAPK信號通路對海馬神經(jīng)元毒性損傷起到一定的保護作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與SE組相比，陽性對照組、SE+DEX組大鼠海馬組織中MAPK、p-ERK、p-CREB蛋白表達量顯著降低，提示DEX可以抑制MAPK、p-ERK、p-CREB表達，推測DEX可能通過抑制MAPK/ERK-CREB通路抑制海馬神經(jīng)元凋亡，對海馬神經(jīng)元損傷發(fā)揮保護作用。

綜上所述，DEX可能通過抑制MAPK/ERK-CREB通路抑制海馬神經(jīng)元凋亡，對其發(fā)揮保護作用。需進一步研究DEX調(diào)控MAPK/ERK-CREB通路治療神經(jīng)性疾病有效性及其調(diào)控其他信號通路的可能作用機制。