缺血性卒中患者IL-23受體基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈粥樣硬化及斑塊易損性的相關(guān)性研究

高媛雪， 徐志昊， 李建剛， 魚 海， 張建軍

眾所周知，頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊是缺血性卒中最主要的危險(xiǎn)因素之一。目前，越來越多學(xué)者認(rèn)識(shí)到頸動(dòng)脈斑塊的危害不僅在于其在血管局部造成的管腔狹窄，斑塊不穩(wěn)定性和破裂對(duì)腦缺血的影響可能更值得關(guān)注[1,2]。白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-23作為一種促炎細(xì)胞因子，可與IL-17的輔助性T細(xì)胞17(T helper cells 17，Th17)組成IL-23/Th17炎癥通路，誘導(dǎo)IL-17分泌，在動(dòng)脈粥樣硬化(atheroscleerosis，AS)發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[3～5]。IL-17可刺激巨噬細(xì)胞釋放IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-β等炎性因子以促進(jìn)AS，增加斑塊不穩(wěn)定性[6,7]；同時(shí)IL-17還可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞釋放多種基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，如MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13等，促進(jìn)斑塊中纖維降解繼而導(dǎo)致斑塊破裂[8,9]。IL-23受體(interleukin-23 receptor，IL-23 R)作為IL-23途徑的重要組成部分，也可能與AS密切相關(guān)。近年來，相繼有研究發(fā)現(xiàn)IL-23R基因存在多個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)與臨床疾病易感性相關(guān)[10,11]。Rs6682925是其中關(guān)注較多的SNP位點(diǎn)之一，多項(xiàng)研究結(jié)果顯示rs6682925 CC基因型是急性冠脈綜合征的危險(xiǎn)因素[12～14]。因此，本研究認(rèn)為有理由推測(cè)IL-23R基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈粥樣硬化及斑塊穩(wěn)定性均密切相關(guān)。為此，本研究以缺血性卒中患者為研究對(duì)象，檢測(cè)IL-23R基因rs6682925位點(diǎn)基因型，探討其與頸動(dòng)脈粥樣硬化及斑塊易損性的關(guān)系，旨在為動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展尋找新的分子遺傳學(xué)標(biāo)記。

1 資料和方法

1.1 一般資料 經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過，連續(xù)收集2019年1月-2019年10月于我科就診的460例缺血性卒中患者納入研究，包括男276例，女184例，平均年齡(65.32±10.57)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡40歲～85歲；(2)缺血性卒中診斷符合2014年中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)指定的《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南》[15]；(3)臨床資料完整，包括頸動(dòng)脈超聲檢查及其他血液檢測(cè)結(jié)果等；(4)長(zhǎng)期居住陜西地區(qū)的漢族人。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心源性缺血性卒中；(2)存在動(dòng)脈炎、梅毒、放射性治療等可能導(dǎo)致頸動(dòng)脈斑塊因素；(3)既往接受頸動(dòng)脈斑塊剝脫或支架植入治療；(4)合并嚴(yán)重的肝腎臟器疾病、惡性腫瘤；(5)妊娠期女性。按照頸動(dòng)脈彩超結(jié)果分為3組，無斑塊組、穩(wěn)定斑塊組和易損斑塊組，其中無斑塊組共112例，包括男60例，女52例，平均年齡(63.72±10.48)歲；穩(wěn)定斑塊組共164例，包括男98例，女66例，平均年齡(66.08±10.15)歲；易損斑塊組共184例，包括男118例，女66例，平均年齡(65.62±11.39)歲，3組間性別及年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。

1.2 方 法

1.2.1 頸部血管超聲檢查 所有檢測(cè)人員經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)，使用東芝Aplio-500超聲診斷儀，檢測(cè)雙側(cè)頸總動(dòng)脈內(nèi)徑及頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(carotid intima media thickness，CIMT)，將CIMT≥1.5 mm并凸向管腔內(nèi)作為診斷頸動(dòng)脈斑塊的標(biāo)準(zhǔn)。采用常規(guī)超聲聯(lián)合微血流成像(superb micmvascular imaging，SMI)技術(shù)評(píng)價(jià)頸動(dòng)脈斑塊性質(zhì)，將頸動(dòng)脈斑塊分為穩(wěn)定斑塊和易損斑塊，易損斑塊的超聲回聲及血流特征：低回聲或極低回聲；斑塊內(nèi)部含低-無回聲區(qū)；潰瘍斑塊；新生血管形成斑塊。本研究將兩側(cè)均為未檢出頸動(dòng)脈斑塊者記入無斑塊組；至少一處斑塊符合易損斑塊超聲回聲及血流特征者記入易損斑塊組；余者記入穩(wěn)定斑塊組。

1.2.2 IL-23R基因rs6682925位點(diǎn)基因型檢測(cè) 采用聚合酶鏈反應(yīng)聯(lián)合DNA直接測(cè)序法檢測(cè)IL-23R基因rs6682925位點(diǎn)基因型。采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(武漢)股份有限公司合成，上游引物：5’-GATCCAGCAATCCCTCTTCT-3’，下游引物：5’-CTCCACCACCCTCTAACCTT-3’，擴(kuò)增片段大小378 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，然后按照95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s順序循環(huán)30周期，最后72 ℃延長(zhǎng)10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)蝦堿性磷酸酶及ExonI純化。最終產(chǎn)物使用美國(guó)ABI 3730XL自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)，使用SeqScape軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 3組間基本臨床特征比較 穩(wěn)定斑塊組和易損斑塊組糖尿病、收縮壓、三酰甘油，與對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；易損斑塊組空腹血糖與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3組在年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、吸煙、高血壓、血脂異常、舒張壓、糖化血紅蛋白、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

2.2 3組間rs6682925位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較 無斑塊組rs6682925位點(diǎn)TT、TC和CC基因型頻率分別為43.75%、41.96%和14.29%；穩(wěn)定斑塊組TT、TC和CC基因型頻率分別為31.10%、43.29%和25.61%；易損斑塊組TT、TC和CC基因型頻率分別為31.52%、40.76%和27.72%。3組rs6682925位點(diǎn)基因型分布頻率經(jīng)檢驗(yàn)均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)，具有良好群體代表性。穩(wěn)定斑塊組和易損斑塊組基因型和等位基因頻率與無斑塊組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；穩(wěn)定斑塊組基因型和等位基因頻率與易損斑塊組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

2.3 rs6682925位點(diǎn)基因型與頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)聯(lián)分析 采用二分類Logisitic回歸分析法，校正年齡、性別、年齡、性別、糖尿病、收縮壓、空腹血糖和三酰甘油等參數(shù)，結(jié)果顯示在缺血性卒中患者中IL-23R基因rs6682925位點(diǎn)CC基因型攜帶者，相對(duì)于TT基因型，穩(wěn)定斑塊和易損斑塊發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)均顯著增加，CC基因型攜帶者頸動(dòng)脈斑塊總體發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型攜帶者的2.616倍(95%CI1.399～4.904，P=0.001)(見表3)。

表1 3組基本臨床特征比較

注：與無斑塊組比較*P<0.05

表2 3組間rs6682925位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

表3 rs6682925位點(diǎn)基因型與頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)聯(lián)分析

注：斑塊組=穩(wěn)定斑塊組+易損斑塊組；a校正年齡、性別、糖尿病、空腹血糖和三酰甘油等

3 討 論

隨著對(duì)AS認(rèn)識(shí)的不斷深入，炎癥反應(yīng)在AS發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用得到了越來越多的共識(shí)。炎癥既是AS重要的起始因素，也是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不斷進(jìn)展，乃至斑塊破裂的促進(jìn)因素。IL-23是2000年才被發(fā)現(xiàn)的一種白介素家族成員，主要表達(dá)與樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)IL-23可通過誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分泌IL-17等炎性介子，級(jí)聯(lián)放大炎性反應(yīng)[3,4]。但是，長(zhǎng)期以來IL-23/Th17通路的相關(guān)研究主要集中在自身免疫性疾病領(lǐng)域，已證實(shí)IL-23/IL-17通路參與炎癥性腸病、銀屑病、強(qiáng)直性脊柱炎和變應(yīng)性鼻炎等疾病的發(fā)展[16]。近年來，不斷有研究報(bào)道IL-23/Th17通路還可能參與AS病理過程[3～9]。黃珊等[17]研究發(fā)現(xiàn) IL-23/Th17炎癥軸可通過激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)冠心病及AS炎癥反應(yīng)。Abbas等[3]研究發(fā)現(xiàn)存在頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的患者血漿IL-23表達(dá)水平較健康對(duì)照組顯著升高，頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中IL-23和IL-23R的mRNA均表達(dá)上調(diào)。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)高血漿IL-23水平可增加患者死亡率。但也有研究結(jié)果得到不同結(jié)論，如Engelbertsen等[18]在IL-23R基因敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)IL-23R缺乏，盡管與T細(xì)胞分化及IL-17表達(dá)密切相關(guān)，但并不影響AS進(jìn)展。因此，有必要繼續(xù)深入探討IL-23/Th17炎癥軸及其中成員在AS中的具體作用。

目前，IL-23R基因多態(tài)性與臨床疾病的相關(guān)性是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。研究報(bào)道IL-23R基因存在多個(gè)SNP位點(diǎn)與冠心病遺傳易感性密切相關(guān)[12～14]。Kave等[13]研究發(fā)現(xiàn)rs11209026基因多態(tài)性與冠脈病變程度相關(guān)。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)rs6682925與冠心病有關(guān)聯(lián)，攜帶C等位基因可能是冠心病的危險(xiǎn)性因素。Zhao等[14]研究結(jié)論與之相似。王棟等[19]研究發(fā)現(xiàn)攜帶rs6682925 CC基因型較TT基因型不穩(wěn)定心絞痛及心肌梗死的患病風(fēng)險(xiǎn)均顯著升高。但I(xiàn)L-23R基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈硬化及斑塊易損性的相關(guān)性研究目前仍鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示缺血性卒中患者rs6682925基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成密切相關(guān)，CC基因型攜帶者頸動(dòng)脈斑塊總體發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型攜帶者的2.616倍，但本研究未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈斑塊易損性存在相關(guān)性。再次提示IL-23/Th17炎癥軸在AS中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但其中各個(gè)成員的實(shí)際生物學(xué)作用及分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

IL-23R基因rs6682925位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄起始位置上游907 bp處的基因內(nèi)含子區(qū)域，該位點(diǎn)T到C的突變可影響外顯子的剪接及轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄和翻譯層次影響IL-23R表達(dá)。Xu等[20]通過熒光素酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)rs6682925 C等位基因可能增加IL-23R的啟動(dòng)子活性。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)冠心病組中，攜帶TC/CC基因型較TT基因型患者外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-23R mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。王棟等[19]研究結(jié)果顯示急性冠脈綜合征患者外周血中血清可溶性IL-23R表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高，但在病例組和對(duì)照組中，不同基因型患者血清可溶性IL-23R表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-23R rs6682925基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈硬化密切相關(guān)，攜帶CC基因型可顯著增加頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，但該位點(diǎn)基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈斑塊易損性無明確相關(guān)性。最后，本研究尚存在以下缺陷：首先，本研究未能深入研究IL-23R rs6682925基因多態(tài)性影響頸動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制。其次，限于條件本研究關(guān)于頸動(dòng)脈粥樣硬化及斑塊易損性的評(píng)估均主要依據(jù)二維超聲結(jié)果，與目前更精確的檢查方式比較，結(jié)果可能存在一定誤差。再次，為提高頸動(dòng)脈硬化及易損斑塊的檢出率，本研究納入研究對(duì)象均為缺血性卒中患者，使得其結(jié)果適用具有一定限制。最后，作為單中心研究，本課題所納入的研究對(duì)象仍相對(duì)較少，期待后續(xù)多中心大樣本及嚴(yán)格設(shè)計(jì)的臨床試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。