單囊胚凍融移植周期中囊胚質(zhì)量對妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局的影響

郭 娜 遠(yuǎn)孝瓊 堯陽城 鄧陶然 杜瑤瑤 騰雪梅 李豫峰

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院生殖中心，湖北省武漢市 430000，電子郵箱：tsguona@126.com)

近年來，隨著社會壓力增大、環(huán)境污染加劇、婦女生育年齡推遲以及二胎政策放開，不孕癥患病率逐年上升[1-2]。高齡、卵巢功能減退的不孕患者越來越多[3]，其臨床表現(xiàn)為卵巢刺激反應(yīng)不佳，獲卵數(shù)少，卵母細(xì)胞質(zhì)量差，可供移植胚胎數(shù)量及質(zhì)量下降[3-4]。大多數(shù)女性會對移植非優(yōu)質(zhì)胚胎的母嬰結(jié)局感到焦慮，臨床醫(yī)生也可能會對移植非優(yōu)質(zhì)胚胎猶豫不決。人類輔助生殖技術(shù)的理想結(jié)局是單胎健康活產(chǎn)。胚胎質(zhì)量是決定體外受精-胚胎移植成功率的主要預(yù)測指標(biāo)。目前，很少有研究關(guān)注胚胎質(zhì)量與妊娠結(jié)局、新生兒結(jié)局的相關(guān)性。本研究通過回顧性分析2 593個單囊胚凍融移植周期的臨床資料，以評估胚胎質(zhì)量對妊娠結(jié)局及新生兒結(jié)局的影響，為改進(jìn)胚胎選擇策略及提高單囊胚凍融周期移植成功率提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2012年1月至2016年12月在我院接受單囊胚凍融移植的2 593個周期的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)夫妻雙方染色體核型正常；(2)單囊胚移植周期；(3)女方宮腔形態(tài)正常，無子宮畸形、宮腔粘連、子宮多發(fā)性內(nèi)膜息肉、子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜結(jié)核，無不良孕產(chǎn)史及反復(fù)流產(chǎn)病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：夫妻雙方任一方存在甲狀腺疾病、糖尿病、高血壓等代謝性疾病史。本研究進(jìn)行單囊胚移植周期的原因如下：(1)新鮮周期移植后僅剩1個符合冷凍標(biāo)準(zhǔn)的囊胚用于冷凍保存；(2)囊胚由于冷凍損傷，復(fù)蘇后僅剩1個存活囊胚可供移植；(3)瘢痕子宮或避免多胎妊娠，復(fù)蘇周期患者僅要求移植1個存活囊胚。采用Gardner囊胚評分體系[5]評估囊胚質(zhì)量，根據(jù)囊胚質(zhì)量不同分為優(yōu)質(zhì)囊胚組1 727個和非優(yōu)質(zhì)囊胚組866個。兩組的女方年齡、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、體質(zhì)指數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度、不孕年限及類型、不孕病因及內(nèi)膜方案比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者夫妻雙方均了解并知情同意。

表1 兩組間基礎(chǔ)資料的比較

1.2 囊胚培養(yǎng)及評估 采用常規(guī)體外受精、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù) (intracytoplasmic sperm injection,ICSI)進(jìn)行受精，16～18 h后進(jìn)行觀察，根據(jù)胚胎卵裂情況，于體外受精后第3天挑選1～2個卵裂期胚胎用于新鮮周期移植或冷凍，剩下的胚胎轉(zhuǎn)移至G2囊胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，將達(dá)到冷凍標(biāo)準(zhǔn)的囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍保存。于體外培養(yǎng)第5、6天對囊胚形態(tài)進(jìn)行評估，按照Gardner囊胚評分體系[5]根據(jù)囊腔擴(kuò)張程度對囊胚進(jìn)行分期：囊腔范圍小于胚胎體積的一半為1期；囊腔范圍超過胚胎體積的一半為2期；囊腔占滿整個胚胎為3期；囊腔完全擴(kuò)張，透明帶變薄為4期； 囊胚開始孵化為5期；囊胚完全孵出為6期。3期及以上的囊胚，則進(jìn)一步對囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass，ICM)和滋養(yǎng)外胚層(trophectoderm，TE)進(jìn)行評級。ICM評級標(biāo)準(zhǔn)[5]：A級為ICM細(xì)胞數(shù)多，緊密成團(tuán)，清晰可見；B級為ICM細(xì)胞數(shù)少，排列松散；C級為ICM細(xì)胞數(shù)極少，幾乎沒有，不清晰。TE評級標(biāo)準(zhǔn)[5]：A級為TE細(xì)胞數(shù)多，呈鐮刀形連續(xù)平鋪；B級為TE細(xì)胞數(shù)少，排列松散；C級為TE細(xì)胞數(shù)極少，幾乎沒有，不清晰。冷凍標(biāo)準(zhǔn)：于囊胚培養(yǎng)第5、6天觀察囊胚形態(tài)，若囊胚在3期及以上，且ICM或TE評級在B級以上，其中3BB及以上的囊胚為優(yōu)質(zhì)囊胚，而AC/BC/CA/CB囊胚為非優(yōu)質(zhì)囊胚。

1.3 囊胚冷凍及復(fù)蘇程序 本研究所用冷凍液、載桿、復(fù)蘇液均購自日本KITAZATO生物制藥有限公司。按照本中心常規(guī)步驟進(jìn)行囊胚冷凍復(fù)蘇[6]。復(fù)蘇后的囊胚均置入37℃的COOK桌面培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 h后觀察囊胚色澤及囊胚腔是否重新擴(kuò)張，囊腔部分或全部擴(kuò)張為存活，進(jìn)行移植。

1.4 內(nèi)膜準(zhǔn)備方法 (1)自然周期：于患者月經(jīng)周期第10～12天采用B超監(jiān)測卵泡及內(nèi)膜，排卵當(dāng)日查血黃體生成素、雌二醇、孕激素水平，于排卵后4～5 d進(jìn)行凍融囊胚移植。(2)人工周期：按遞增法口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂，德國拜耳制藥)，服用方法為月經(jīng)第2～4天2 mg/d(1次/d),第5～8天2 mg/d(2次/d),第9～12天3 mg/d(2次/d),根據(jù)內(nèi)膜厚度調(diào)整用藥量及時間。當(dāng)內(nèi)膜厚度達(dá)到7 mm及以上且雌激素作用時間不少于10 d時，給予黃體酮轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，在轉(zhuǎn)化的第6天進(jìn)行囊胚解凍。

1.5 移植后的支持治療 黃體支持方案有兩種：(1)黃體酮陰道緩釋凝膠(默克雪蘭諾公司，規(guī)格：90 mg/支)，90 mg/次，1次/d，置于陰道；并口服地屈孕酮(蘇威制藥廠，規(guī)格：10 mg/片)，10 mg/次，2次/d。移植后繼續(xù)給藥至12 d驗(yàn)血。(2)黃體酮軟膠囊(法國法杏大藥廠，規(guī)格：100 mg/粒)，200 mg/次，1次/d，置于陰道；并口服地屈孕酮，20 mg/次，2次/d。移植后繼續(xù)給藥至12 d驗(yàn)血。

1.6 妊娠及新生兒結(jié)局的評估 (1)著床：囊胚移植4～6周行陰道B超可見到孕囊數(shù)目。著床率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%。(2)臨床妊娠：囊胚移植后12 d查血β人絨毛膜促性腺激素陽性，且移植后4～6周行陰道B超可見孕囊，包括宮外孕。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。(3)早期流產(chǎn)：妊娠后于12周前終止為早期流產(chǎn)。早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。(4)異位妊娠：囊胚在子宮腔以外著床。異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。(5)活產(chǎn)：胎兒娩出后至少具有以下一項(xiàng)生命體征，包括心跳、呼吸、臍帶搏動、隨意肌收縮?；町a(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。(6)多胎妊娠：移植后早孕期B超見到2個及以上的孕囊。多胎妊娠率=多胎妊娠周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。(7)引產(chǎn)：因發(fā)現(xiàn)胎兒畸形、母親嚴(yán)重妊娠并發(fā)癥而不能繼續(xù)妊娠或其他原因(不包括死胎)人為終止妊娠。引產(chǎn)率=引產(chǎn)周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%。(8)母體并發(fā)癥：主要包括妊娠期高血壓疾病、妊娠期糖尿病、胎膜早破、前置胎盤等。(9)低出生體重兒：出生體重小于2 500 g。(8)極低出生體重兒：出生體重小于1 500 g。(10)巨大兒：出生體重大于4 000 g。(11)早產(chǎn)：活產(chǎn)周期中，滿20周至37周前分娩。(12)出生缺陷：在出生時或出生以后表現(xiàn)的結(jié)構(gòu)、功能或發(fā)育異常，可能是由出生前遺傳或非遺傳因素造成。(13)圍生期死亡兒：死產(chǎn)及胎兒娩出后早期新生兒死亡。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以[M(P25，P75)]計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組的妊娠結(jié)局比較 優(yōu)質(zhì)囊胚組有1 288個(74.58%)常規(guī)體外受精周期和439個(25.42%)ICSI周期，非優(yōu)質(zhì)囊胚組有604個(69.75%)常規(guī)體外受精周期和262個(30.25%)ICSI周期，優(yōu)質(zhì)囊胚組常規(guī)體外受精比例高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組，ICSI比例低于非優(yōu)質(zhì)囊胚組(χ2=6.833，P=0.009)。優(yōu)質(zhì)囊胚組著床率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率均高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組(均P<0.05)，而兩組間異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、多胎妊娠率、引產(chǎn)率及母體并發(fā)癥發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表2。優(yōu)質(zhì)囊胚組共9個周期引產(chǎn)，其中4例因胎兒畸形(腎臟畸形1例、脊柱畸形1例、心臟畸形1例、唇腭裂1例)引產(chǎn)，2例因染色體異常引產(chǎn)，另外3例因孕中期胎死宮內(nèi)而引產(chǎn)；非優(yōu)質(zhì)囊胚組共4個周期引產(chǎn)， 其中2例因胎兒畸形(唇腭裂1例，腦部結(jié)構(gòu)發(fā)育異常1例)引產(chǎn)，1例胎膜早破而引產(chǎn)，1例重度子癇而引產(chǎn)。

表2 兩組間妊娠結(jié)局的比較[n(%)]

注：優(yōu)質(zhì)囊胚組的27個多胎妊娠周期中，中途流產(chǎn)15個，最終只有12個雙胎活產(chǎn)周期；非優(yōu)質(zhì)囊胚組的6個多胎妊娠周期均在中途流產(chǎn)。

2.2 兩組新生兒一般情況及結(jié)局比較 優(yōu)質(zhì)囊胚組有12個雙胎妊娠活產(chǎn)周期(其中8個為男性雙胎，4個為女性雙胎)，非優(yōu)質(zhì)囊胚組無雙胎活產(chǎn)周期。本研究僅比較兩組間單胎妊娠的新生兒結(jié)局。優(yōu)質(zhì)囊胚組男性新生兒比例高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組(P<0.05)，兩組間新生兒分娩方式、出生時孕周、出生體重以及早產(chǎn)兒比例、低出生體重兒比例、極低出生體重兒比例、巨大兒比例、圍生期死亡兒比例、出生缺陷發(fā)生率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表3。優(yōu)質(zhì)囊胚組單胎妊娠新生兒有3例出生缺陷，包括心臟發(fā)育不良1例、女嬰卵巢囊腫1例、軟腭裂1例；非優(yōu)質(zhì)囊胚組單胎妊娠新生兒有2例出生缺陷，包括Turner綜合征1例、左心室未閉合1例。

表3 兩組單胎妊娠新生兒一般情況及結(jié)局的比較

3 討 論

目前，在世界范圍內(nèi)每6對夫妻中就有一對受到不孕癥的影響，這影響了家庭穩(wěn)定及社會和諧。自1978年世界上第1例試管嬰兒誕生以來，人類輔助生殖技術(shù)獲得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，給許多不孕癥患者家庭帶來了福音。但是，伴隨著床率提高的同時，醫(yī)源性多胎妊娠已經(jīng)成為人類輔助生殖技術(shù)最常見的并發(fā)癥之一。單胚胎移植被認(rèn)為是減少多胎妊娠的最佳方法，而胚胎質(zhì)量則是影響單胚胎移植成功率的主要因素。有學(xué)者認(rèn)為胚胎質(zhì)量與著床率、臨床妊娠率相關(guān)[7]，而其與產(chǎn)科結(jié)局和新生兒結(jié)局的關(guān)系卻尚不清楚。移植不同質(zhì)量的胚胎對母嬰結(jié)局的影響，成為生殖專家及不孕癥患者們共同關(guān)注的問題。

成功的人類輔助生殖技術(shù)妊娠依賴于良好的子宮內(nèi)膜容受性，同時選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植也是影響其結(jié)果的重要因素。有研究表明，移植質(zhì)量較差的胚胎可能會降低臨床妊娠率和活產(chǎn)率[8]，這可能是因?yàn)橘|(zhì)量較差的胚胎具有較高的非整倍體率[9]。本研究通過設(shè)置嚴(yán)格的納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，排除了移植胚胎個數(shù)和子宮內(nèi)膜容受性等因素，采用凍融周期單囊胚移植模型來研究胚胎質(zhì)量對母體和子代的影響，結(jié)果顯示優(yōu)質(zhì)囊胚組的臨床妊娠率及活產(chǎn)率高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組(P<0.05)。這可能與受精方式的不同影響了妊娠結(jié)局有關(guān)：與非優(yōu)質(zhì)囊胚組比較，優(yōu)質(zhì)囊胚組常規(guī)體外受精的比例更高，而ICSI的比例更低(P<0.05)。既往研究表明，ICSI雖然可以改善獲卵數(shù)少的患者的受精率，但并不能提高胚胎利用率、優(yōu)質(zhì)胚胎率[10]。與常規(guī)體外受精過程相比，ICSI將單個精子直接注射到卵母細(xì)胞內(nèi)，可能增加了對卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，同時繞過了卵母細(xì)胞對精子自然選擇的屏障，使質(zhì)量差的精子受精，從而影響了胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局。有學(xué)者認(rèn)為，選擇形態(tài)學(xué)評分較差的胚胎進(jìn)行移植，一旦達(dá)到臨床妊娠，大多數(shù)都可獲得活產(chǎn)，這對于反復(fù)出現(xiàn)胚胎發(fā)育較差的女性而言是不錯的選擇[11]。而在本研究中，移植質(zhì)量較差的囊胚也能獲得33.6%的活產(chǎn)率。

目前，有關(guān)胚胎質(zhì)量對新生兒結(jié)局影響的研究報道較少。有學(xué)者認(rèn)為，胚胎質(zhì)量對母體及子代健康的影響不應(yīng)忽略不孕因素本身會增加圍生期風(fēng)險，比如早產(chǎn)、低出生體重兒、子癇前期、胎膜早破等，其中卵巢早衰可能會增加母體并發(fā)癥發(fā)生率[7]。而本研究中，不同質(zhì)量胚胎組在母體并發(fā)癥發(fā)生率、分娩方式、孕周、出生體重、早產(chǎn)兒比例、低出生體重兒比例、極低出生體重兒比例、巨大兒比例、出生缺陷發(fā)生率等方面差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Oron等[7]在研究1541例新鮮單胚胎移植周期臨床結(jié)局時發(fā)現(xiàn)，移植質(zhì)量較差的胚胎并未增加圍生期和新生兒不良結(jié)局的發(fā)生率。Nakagawa等[11]在評估移植胚胎質(zhì)量與最終圍產(chǎn)結(jié)局關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，移植質(zhì)量較差的胚胎達(dá)到臨床妊娠的可能性雖然低于移植優(yōu)質(zhì)胚胎，但一旦達(dá)到臨床妊娠，其獲得活產(chǎn)的概率以及圍生期結(jié)局與移植優(yōu)質(zhì)胚胎者相似，這一研究結(jié)果為只能選擇劣質(zhì)胚胎進(jìn)行移植的患者提供了良好的心理安慰和有力的數(shù)據(jù)支撐。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果類似，然而局限于本研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣本量，所得結(jié)論需要樣本量更大的前瞻性研究加以驗(yàn)證。此外本研究中，優(yōu)質(zhì)囊胚組男性新生兒比例高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組(P<0.05)，這可能與非優(yōu)質(zhì)囊胚組ICSI比例更高有關(guān)，行ICSI治療的夫婦多為男性不育，其含Y染色體精子的受精能力下降，或含X染色體的精子比含Y染色體的精子更容易優(yōu)先獲得[12]。Huang等[13]利用Timelapse延時攝像系統(tǒng)觀察胚胎發(fā)育動力學(xué)參數(shù)與活產(chǎn)胎兒性別之間關(guān)系，發(fā)現(xiàn)男胚比女胚生長速度快，當(dāng)胚胎冷凍復(fù)蘇時，優(yōu)質(zhì)男胚更容易被選中移植。

綜上所述，單囊胚凍融移植周期中，囊胚質(zhì)量雖然會影響母體妊娠率和活產(chǎn)率，但移植質(zhì)量較差的囊胚并不會增加圍生期不良結(jié)局和新生兒缺陷的發(fā)生率。選擇質(zhì)量差的胚胎進(jìn)行移植對于反復(fù)出現(xiàn)胚胎發(fā)育較差的女性而言會是不錯的選擇。