基于質(zhì)譜技術(shù)的脂肪酸定量分析及其與慢性疾病關(guān)系的研究進(jìn)展

李 娜，李智立

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院,生物物理及結(jié)構(gòu)生物學(xué)系，北京 100005)

脂肪酸是含有羧基的鏈烴,其參與生命體的能量代謝，是細(xì)胞膜的主要成分。依據(jù)脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度可分為：碳原子數(shù)小于6的短鏈脂肪酸、碳原子數(shù)介于7～12的中鏈脂肪酸、碳原子數(shù)介于13～20的長(zhǎng)鏈脂肪酸，以及碳原子數(shù)大于20的超長(zhǎng)鏈脂肪酸；依據(jù)脂肪酸碳鏈飽和度可分為：飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸及多不飽和脂肪酸；根據(jù)不飽和脂肪酸第1個(gè)不飽和雙鍵距離甲基端位置的遠(yuǎn)近可分為ω-3族、ω-6族、ω-9族脂肪酸等；根據(jù)不飽和脂肪酸雙鍵的構(gòu)型可分為順式脂肪酸和反式脂肪酸。脂肪酸在人體內(nèi)以游離脂肪酸(Free fatty acids，F(xiàn)FAs)和酯化脂肪酸(Esterified fatty acids，EFAs)兩種形式存在。其中FFAs在生命體內(nèi)占比較少[1]，絕大部分以EFAs形式存在，而EFAs主要以磷脂、糖脂以及脂蛋白等形式存在，其在血液運(yùn)輸中會(huì)與白蛋白結(jié)合。

脂肪酸會(huì)影響機(jī)體的生理功能及健康狀態(tài)，越來越多的證據(jù)顯示脂肪酸與炎癥[2]、肥胖[3]、糖尿病[3-4]、癌癥[5-7]以及阿爾茨海默氏病[8]等慢性疾病密切相關(guān)。

1 脂肪酸的檢測(cè)

脂肪酸在高溫下容易發(fā)生脫羧、裂解和熱還原反應(yīng)。應(yīng)用氣相色譜分離脂肪酸時(shí)，需要對(duì)脂肪酸進(jìn)行衍生化，以增加其揮發(fā)性，降低極性，其中脂肪酸甲酯化是一種常用的衍生化方法[9-10]。在進(jìn)行高效液相色譜分析之前，需利用衍生化試劑(如氯化萘[11-12]、鄰苯二甲酸酐[13]、苯酐[14]和2-磺基苯二甲酸酐[15]等)進(jìn)行柱前衍生化，引入紫外吸收基團(tuán)后可用紫外檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器等對(duì)脂肪酸進(jìn)行檢測(cè)。近紅外光譜法也是一種快速、高通量、低成本的脂肪酸分析方法[16]。采用核磁共振波譜法可通過添加苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)物，開展脂肪酸的定量分析[17]。 質(zhì)譜法可對(duì)脂肪酸等生物分子進(jìn)行高通量的定性和定量分析[18-20]。本文主要綜述了采用質(zhì)譜法定量分析不同病理生理?xiàng)l件下脂肪酸含量及其與疾病關(guān)系的研究結(jié)果。

2 脂肪酸與慢性疾病

2.1 脂肪酸與糖尿病

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病。以氨水處理的N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽(NEDC)作為基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)檢測(cè)脂肪酸的基質(zhì)，可降低NEDC基質(zhì)效應(yīng)的影響。通過建立定量分析曲線，對(duì)339例血清樣本(包括161例健康對(duì)照、118例糖尿病患者、60例非糖尿病患者)中的7個(gè)血清FFAs(C16∶0、C18∶3、C18∶2、C18∶1、C18∶0、C20∶4和C22∶6)進(jìn)行絕對(duì)定量分析。研究結(jié)果表明，上述FFAs在糖尿病患者中明顯升高，且大多數(shù)脂肪酸的含量隨著血糖值升高而呈上升趨勢(shì)；受試者工作曲線分析結(jié)果表明，C18∶3、C18∶2、C18∶1、C20∶4和C22∶6的組合具有較高的診斷能力，可以區(qū)分健康對(duì)照和糖尿病患者或非糖尿病患者，其診斷精度、靈敏度和特異度分別大于0.97、90%和91%。該組合還可區(qū)分糖尿病患者和非糖尿病患者，其診斷精度、靈敏度和特異度分別為0.94、92.4%和83.3%[18]。通過堿水解方法可獲得血清中的EFAs，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離-質(zhì)譜分析了1 828例血清(包括543例對(duì)照、655例糖尿病前期患者、630例2型糖尿病)中的14種EFAs(C16∶0、C18∶0、C16∶1、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶1、C20∶2、C20∶3、C20∶4、C20∶5、C22∶4、C22∶5和C22∶6)。研究結(jié)果揭示，C18∶1和C20∶3在3組人群中的表達(dá)水平具有顯著差異；糖尿病患者血液中的EFAs水平顯著高于健康對(duì)照和無高血糖患者[21]。高表達(dá)的飽和FFAs和ω-6 多不飽和脂肪酸會(huì)引起糖耐量受損和胰島素抵抗[22]。血液中的FFAs增加可將脂肪酸儲(chǔ)存在非脂肪組織，如肝臟、肌肉、心臟和胰島。這種脂質(zhì)異位沉積將導(dǎo)致代謝相關(guān)的細(xì)胞發(fā)生功能障礙，引起細(xì)胞程序性死亡。羥基脂肪酸脂肪酸酯是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新型脂肪酸，其為羥基脂肪酸與脂肪酸的酯化反應(yīng)產(chǎn)物，可促進(jìn)胰島素的分泌和葡萄糖的攝取，且具有抗炎作用[23-24]。

2.2 脂肪酸與癌癥

采用NanoESI-FTICR MS技術(shù)對(duì)2 861例血清中的 6種FFAs(C16∶1、C18∶3、C18∶2、C18∶1、C20∶4和C22∶6)與不同慢性疾病的關(guān)系進(jìn)行了研究。通過建立定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率等考察后，實(shí)現(xiàn)了對(duì)上述6種FFAs的絕對(duì)定量分析。與健康對(duì)照比較，發(fā)現(xiàn)FFAs在胰腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌和甲狀腺癌患者血液中的含量均呈下調(diào)趨勢(shì)，而在非癌的慢性疾病患者血液中則呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)[6]；受試者工作曲線分析結(jié)果表明，C18∶2/C18∶1和 C18∶3/C18∶1的組合能夠識(shí)別早期胰腺癌，其診斷精度、靈敏度和特異度分別為0.912、86.7%和88.6%[20]；C16∶1、C18∶3、C18∶2、C18∶1、C20∶4和C22∶6的組合能夠?qū)⒃缙诜伟┡c非癌人群區(qū)分開，其診斷精度、靈敏度和特異度分別為0.933、84.2%和89.1%[25]；C16∶1、C18∶3、C18∶2、C20∶4和C22∶6的組合能夠識(shí)別早期胃癌[26]、結(jié)直腸癌[5]和乳腺癌[27]，其診斷精度、靈敏度和特異度分別優(yōu)于0.82、80%和72%，且這些研究結(jié)果明顯優(yōu)于臨床上使用的癌胚抗原和CA19-9等傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物的診斷精度、靈敏度和特異度。采用碳納米材料-氧化石墨烯作為MALDI MS分析的基質(zhì)，對(duì)血清中的12種EFAs(C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20∶2、C20∶3、C20∶4、C20∶5、C22∶5和C22∶6)進(jìn)行絕對(duì)定量分析。研究結(jié)果表明，不同性別之間的脂肪酸含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但不同病理生理狀態(tài)下、不同年齡段之間的脂肪酸含量卻存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與健康對(duì)照人群相比，肺癌患者的C16∶0、C18∶0、C18∶1和C18∶3含量均明顯升高，肺部良性疾病患者的C20∶2、C20∶4、C20∶5、C22∶5和C22∶6含量均明顯下降。與臨床常用的腫瘤標(biāo)志物(癌胚抗原和細(xì)胞角蛋白19片段)相比，發(fā)現(xiàn)C18∶2、C20∶3、C20∶4、C20∶5、C22∶5和C22∶6的組合，C18∶0、C20∶4、C20∶5和C22∶6的組合以及C16∶1、C18∶0、C18∶1、C20∶3和C22∶6的組合可區(qū)分肺部良性疾病患者和肺癌患者[19]。肺癌患者血清中FFAs及其氧化代謝物的水平顯著升高，其中花生四烯酸、亞油酸和15-羥基二十碳四烯酸組合具有較好的區(qū)分腺癌與非癌的能力[7]。短鏈脂肪酸是腸道細(xì)菌發(fā)酵的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，飲食中的多聚糖在結(jié)腸內(nèi)可被微生物代謝成低聚糖，然后發(fā)酵成乙酸、丙酸和丁酸等短鏈飽和脂肪酸，這些短鏈脂肪酸對(duì)人的能量代謝具有重要影響，與膳食纖維的抗炎作用和降低結(jié)腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[28-29]。

2.3 脂肪酸與心血管疾病

心血管疾病是一類涉及心臟或血管的疾病統(tǒng)稱。前期研究采用LC-MS/MS技術(shù)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中檢出C14∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、α-C18∶3、γ-C18∶3、C20∶4、 C20∶5和C22∶6等10種脂肪酸[30]。采用LC-MS對(duì)食用ω-3多不飽和脂肪酸降低心血管疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的受試者血清中C20∶5和C22∶6進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)這些脂肪酸的血液濃度與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)[31]。采用GC-MS對(duì)漢族正常人和冠心病患者血液中脂肪酸進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)C14∶0、C16∶0、C18∶0、trans-C18∶1、C22∶6、C20∶5和C20∶4脂肪酸與冠心病顯著相關(guān)[32]。 對(duì)歐洲人群的研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的單不飽和FFAs與心血管風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[33]，而高表達(dá)的ω-6多不飽和脂肪酸能降低心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[34]。對(duì)非糖尿病人群，血液中的ω-3和ω-6 多不飽和脂肪酸表達(dá)水平增加會(huì)降低未來患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[35]。C20∶5/C20∶4比值較高的人，其患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低[36-37]。這些研究結(jié)果表明血液中FFAs的表達(dá)水平與心血管事件的發(fā)生密切相關(guān)。

3 總結(jié)與展望

脂肪酸作為人體內(nèi)重要的代謝產(chǎn)物和能量來源，其種類及含量的變化對(duì)不同類型慢性疾病的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用。脂肪酸與慢性疾病關(guān)系的研究，既要關(guān)注脂肪酸的種類及其含量變化，又要關(guān)注其更深層次的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型變化[38]。將不同分離技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，開展定性和定量的脂肪酸更精細(xì)的結(jié)構(gòu)分類研究，從而建立脂肪酸“量變”和結(jié)構(gòu)變化(“質(zhì)變”)與慢性疾病發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系，將是質(zhì)譜學(xué)研究的重要方向之一。