樺褐孔菌總多糖抗糖尿病作用的研究

張 苗,李建寬,葛 睿,孟靜一,李青山,*

(1山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院,基于炎性反應(yīng)的重大疾病創(chuàng)新藥物山西省重點實驗室,晉中 030619;2山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院;*通訊作者,E-mail:sxlqs2012@163.com)

糖尿病是一種慢性代謝性疾病,國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)報告指出,到2045年,估計約有6.29億或更多的糖尿病患者[1]。糖尿病的臨床治療主要集中于提高血胰島素水平和改善組織的胰島素敏感性,如磺脲類、二甲雙胍、噻唑烷二酮類、腸降血糖素模擬物和二肽基肽酶Ⅳ(DDP-4)抑制劑[2-4]。然而,這些治療的藥物有很多副作用,例如血糖過低、體質(zhì)量增加以及療效隨時間推移而降低,這都限制了藥物在臨床的應(yīng)用[2,3]。越來越多的研究表明,多種天然產(chǎn)物在治療糖尿病方面表現(xiàn)出潛在的優(yōu)勢,并且由于其潛在的作用和較小的副作用,成為糖尿病治療研究的一個重要方面[4-7]。

樺褐孔菌(Inonotusobliquus(Pers.) Pil.)是一種珍貴藥用真菌,屬于膽子菌門多孔菌科的一種,傳統(tǒng)上用于治療胃腸道疾病、心血管疾病、癌癥和糖尿病[8-10]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,樺褐孔菌多糖具有多種生物活性,其中包括抗糖尿病作用[11-14]。樺褐孔菌廣泛分布于北半球北緯40°-50°的地區(qū),如波蘭、俄羅斯、日本北海道、中國黑龍江、中國吉林等國家和地區(qū)[10]。郭尚等[15]報道在山西省呂梁山地區(qū)也有樺褐孔菌分布。本文主要對采自山西呂梁山地區(qū)的樺褐孔菌對大鼠抗糖尿病活性及其對血脂調(diào)控、胰臟和肝臟損傷的保護作用進行探討,為山西產(chǎn)樺褐孔菌的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

鏈脲佐菌素(STZ)來源于北京Solarbio生物科技有限公司;格列本脲購自天津太平洋制藥有限公司;甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)和胰島素(INS)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA N-1100S)購自日本東京理化器械株式會社(Tokyo,Japan);凍干機(FD8-3)購自美國GOLD-SIM公司(California,USA);Sinocare GA-3型血糖儀購自三諾生物傳感股份有限公司(中國深圳);AV-400光譜儀購自德國Bruker公司(Rheinstetten,Germany)。

1.2 材料

樺褐孔菌采自山西省呂梁山地區(qū),經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院李建寬副教授鑒定為樺褐孔菌Inonotusobliquus(Pers.) Pil.。標本(2017002002)存放于山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院植物標本室。

1.3 IOTP的制備

1 000 g樺褐孔菌搗碎成粗粉。在90 ℃,用蒸餾水(5 L)提取3次,每次1.5 h合并提取液。過濾,將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃條件下濃縮至1/4。濃縮濾液中加入95%乙醇沉淀使其乙醇濃度為80%,放置過夜。次日離心(3 000 r/min,15 min)取上清,過D101樹脂柱,水洗脫,得水洗脫液。將水洗脫液在凍干機上進行冷凍干燥,得樺褐孔菌總多糖(130 g)。將50 mg IOTP溶在0.5 ml的氘代水中,在AV-400光譜儀中檢測1H-NMR。

1.4 動物分組及給藥

SD雄性大鼠(160-180 g)50只購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司(證書許可證號:SCXK 2019-0010)。動物飼養(yǎng)條件如下:溫度為(24±2)℃,相對濕度為(50±5)%,光照亮/暗循環(huán)12 h。動物自由飲食和進水。普通飼料購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。大鼠飼養(yǎng)2周適應(yīng)期后開展實驗。

用新鮮制備的STZ檸檬酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH=4.5)60 mg/kg單次腹腔注射進行造模[16],1周后,檢測血糖,血糖值高于11.1 mmol/L的大鼠被認為造模成功。造模成功的大鼠隨機分為4組:模型組(n=10),陽性對照組(格列本脲,800 μg/kg,n=10),IOTP 400 mg/kg組(n=10)和IOTP 800 mg/kg組(n=10)。未注射STZ的大鼠(n=10)作為正常對照組。格列本脲和IOTP溶解在蒸餾水中,灌胃,每日一次,持續(xù)14 d。正常組大鼠和模型組大鼠口服相同量的蒸餾水。

1.5 采樣及檢測

每周測量體質(zhì)量和空腹血糖值。治療的第13天,各組大鼠禁食12 h后,進行口服葡萄糖耐受能力(OGTT)實驗?？诜咸烟?2.5 g/kg)溶液,分別于0,30,60,90,120 min收集尾尖血液,進行血糖檢測。第14天,用10%水合氯醛麻醉動物,從腹主動脈收集血樣并以3 000 r/min離心15 min收集血清,檢測血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、AST、ALT、LDH、INS的水平。取胰腺組織,經(jīng)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋后制成3 μm的切片用于HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 IOTP的1H-NMR

IOTP1H-NMR結(jié)果表明,在δ=3.0-4.0區(qū)間信號歸屬為IOTP糖上的質(zhì)子信號(見圖1)。δ=4.5-5.0區(qū)間信號歸屬為殘留溶劑水的信號。

圖1 IOTP的1H-NMR圖

2.2 IOTP對糖尿病大鼠體質(zhì)量、血糖和OGTT的影響

2.2.1 IOTP對糖尿病大鼠體質(zhì)量的影響 與正常對照組相比,造模前的其余四組大鼠的體質(zhì)量沒有顯著變化(P>0.05);與正常對照組相比,治療2周后其余四組大鼠的體質(zhì)量均顯著降低,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,見表1)。

表1 IOTP對大鼠體質(zhì)量的影響 (g)

Table 1 Effects of IOTP on body weight in rats (g)

組別n造模前 治療2周正常對照組10264.30±36.17290.80±48.54模型組10229.00±10.69224.00±18.92??陽性對照組10232.30±25.02231.30±22.62??IOTP400mg/kg組10226.70±16.19204.60±30.45??IOTP800mg/kg組10240.10±16.08237.30±19.41??

與正常對照組相比,**P<0.01

2.2.2 IOTP對大鼠血糖的影響 治療2周后,與正常對照組相比,模型組大鼠的血糖值顯著升高(P<0.01);與模型組相比,IOTP兩劑量組和陽性對照組大鼠的血糖值顯著降低(P<0.01,見表2)。

表2 IOTP對大鼠血糖水平的影響 (mmol/L)

Table 2 Effects of IOTP on blood glucose levels in rats (mmol/L)

組別n造模1周 治療2周正常對照組105.11±1.334.90±1.45模型組1014.19±1.5721.22±2.49??陽性對照組1013.51±2.3117.03±3.29##IOTP400mg/kg組1013.89±2.1118.97±2.56##IOTP800mg/kg組1014.15±2.0112.66±3.63##

與正常對照組相比,**P<0.01;與模型組相比,##P<0.01

2.2.3 IOTP對糖尿病大鼠口服葡萄糖耐量的影響 口服葡萄糖后，所有試驗組大鼠血糖水平在30 min內(nèi)達到峰值，隨后開始下降。陽性對照組和IOTP 800 mg/kg組，模型組和IOTP 400 mg/kg組血糖值在60，90，120 min時相比有顯著差異(P<0.01，見圖2)。

與模型組相比,**P<0.01

2.3 IOTP對糖尿病大鼠胰島素和血脂的影響

與正常對照組相比,模型組大鼠的血胰島素、HDL-C水平顯著下降(P<0.01),TC、TG和LDL-C水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,IOTP兩劑量組和陽性對照組血胰島素和HDL-C水平顯著升高(P<0.01),TC、TG和LDL-C水平顯著降低(P<0.05,見表3)。

2.4 IOTP對糖尿病大鼠肝酶活性的影響

與正常對照組相比,模型組的AST、ALT和LDH活性顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,IOTP 800 mg/kg組和陽性對照組AST、ALT和LDH的活性顯著降低(P<0.01,見表4),IOTP 400 mg/kg組AST和ALT活性顯著降低(P<0.05或0.01),LDH活性雖然降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 IOTP對大鼠血胰島素和血脂的影響

Table 3 Effects of IOTP on blood insulin and lipid profile in rats

組別nINS/(mU/L)TC/(mmol/L)TG/(mmol/L)LDL-C/(mmol/L)HDL-C/(mmol/L) 正常對照組1029.42±0.461.08±0.250.32±0.102.44±0.232.08±0.37 模型組1010.02±1.14??1.48±0.11?0.58±0.08??3.70±0.29??0.66±0.12?? 陽性對照組1022.13±0.71##0.85±0.19##0.24±0.08##1.43±0.41##1.46±0.49## IOTP400mg/kg組1019.44±0.41##0.97±0.14##0.38±0.08#2.91±0.69##1.45±0.22## IOTP800mg/kg組1022.44±1.64##0.95±0.20##0.25±0.02##1.32±0.41##1.01±0.15##

與正常對照組相比,*P<0.05,**P<0.01;與模型組相比,#P<0.05,##P<0.01

表4 IOTP對肝酶ALT、AST和LDH活性的影響 (IU/L)

Table 4 Effects of IOTP on liver enzyme ALT、AST and LDH activities (IU/L)

組別nALTASTLDH 正常對照組1057.14±11.16108.20±11.07306.50±1.15模型組10272.50±13.69??363.00±28.48??574.60±12.88??陽性對照組10139.70±16.35##172.00±26.29##323.80±38.83##IOTP400mg/kg組10130.50±16.98##230.80±70.39#545.80±18.85IOTP800mg/kg組10103.00±11.44##124.30±20.28##351.40±16.29##

與正常對照組相比,**P<0.01;與模型組相比,#P<0.05,##P<0.01

2.5 IOTP對糖尿病大鼠胰腺形態(tài)學(xué)特征的影響

模型組大鼠胰腺細胞出現(xiàn)明顯的空泡化和胰島萎縮。IOTP作用14 d后胰島萎縮和胰腺細胞空泡化程度明顯減弱,尤其在IOTP在800 mg/kg劑量下作用更顯著(見圖3)。

A.正常對照組;B.模型組;C.陽性對照組;D.IOTP 400 mg/kg組;E.IOTP 800 mg/kg組

3 討論

糖尿病是一種慢性代謝性疾病,其發(fā)病率逐年上升,嚴重影響著人類健康。從中藥中提取潛在的生物活性物質(zhì)來有效控制糖尿病是一項重要策略。大量文獻報道[16,17],STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型簡單有效,因而被廣泛應(yīng)用。陽性藥格列本脲劑量的確定是根據(jù)市場上銷售的藥物格列本脲片人的有效劑量換算大鼠的等效劑量。成人每天服用格列本脲的有效劑量為7.5 mg。大鼠的等效劑量=成人每天服用的有效劑量×6.3÷人的質(zhì)量=7.5 mg/60 kg×6.3≈800 μg/kg。本文研究結(jié)果表明,單次腹腔注射60 mg/kg STZ檸檬酸鈉緩沖溶液可引起大鼠血糖顯著升高,胰島素水平和體質(zhì)量顯著降低。格列本脲和IOTP(400 mg/kg或/和800 mg/kg)可顯著抑制STZ引起的大鼠高血糖和胰島素水平。

本文實驗中STZ誘導(dǎo)同時也引起大鼠血脂(TG、TC、LDL-C和HDL-C)水平的改變,這種改變在之前的文獻中也有報道[18-20]。本研究中60 mg/kg STZ檸檬酸鈉緩沖溶液引起大鼠TG、TC、LDL-C顯著升高,HDL-C顯著降低。然而IOTP能夠顯著降低TG、TC和LDL-C水平,升高HDL-C水平。因此,IOTP調(diào)節(jié)血糖的同時還能夠調(diào)節(jié)血脂。

肝臟是機體重要的代謝器官。外源性STZ對大鼠肝臟損害的影響在以往的研究中已經(jīng)有了較為全面的評價,血液中LDH、AST和ALT的活性被認為是肝損害的關(guān)鍵指標[21-23]。本文研究結(jié)果表明,IOTP對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清中LDH、AST和ALT活性的顯著升高具有明顯的抑制作用,表明IOTP對STZ誘導(dǎo)的肝臟損傷具有一定保護作用。

胰腺組織病理學(xué)表示,模型組胰腺細胞出現(xiàn)明顯的空泡化和胰島萎縮,形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生病理學(xué)改變。IOTP治療后胰島萎縮和胰腺細胞空泡化程度明顯減弱,且隨著劑量的升高作用更強,表明IOTP能夠抑制STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的胰腺損傷。

綜上所述,采自山西呂梁山地區(qū)的樺褐孔菌對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠不僅具有顯著降糖作用,而且能夠調(diào)節(jié)血脂、抑制胰臟和肝臟的損傷。本文研究結(jié)果為山西產(chǎn)樺褐孔菌的進一步開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。