長(zhǎng)鏈非編碼RNA NEAT1在銀屑病中的表達(dá)及其與疾病活動(dòng)度和炎癥因子水平的關(guān)聯(lián)分析

金 曌， 李聰慧， 程 楊， 蘇 慧， 付 霆

銀屑病是一種多基因遺傳背景下自身免疫紊亂導(dǎo)致的炎性皮膚病，在中國(guó)其總患病率約為0.47%，男女患病率無差異[1-4]。由于銀屑病病程長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)及難以治愈等特點(diǎn)，患者的預(yù)后仍然不容樂觀。因此亟需尋找與銀屑病患病風(fēng)險(xiǎn)和疾病活動(dòng)度有關(guān)的生物標(biāo)記物來監(jiān)測(cè)患者病情和改善患者的預(yù)后。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)核富集轉(zhuǎn)錄本1(nuclear enriched abundant transcript 1, NEAT1)在免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者單核細(xì)胞中過表達(dá)，且與疾病活動(dòng)度、炎癥因子表達(dá)量呈正相關(guān)；在骨關(guān)節(jié)炎患者中，lncRNA NEAT1的過表達(dá)和滑膜細(xì)胞的增生、炎癥因子表達(dá)量上調(diào)有關(guān)[5-6]。這些研究表明，lncRNA NEAT1在炎癥性疾病發(fā)生和進(jìn)展過程扮演著重要角色。銀屑病作為一種典型的炎癥性皮膚病，lncRNA NEAT1也可能參與其發(fā)生、發(fā)展過程。本研究旨在評(píng)估lncRNA NEAT1在銀屑病患者病變皮膚組織中的表達(dá)水平以及其與疾病嚴(yán)重程度和炎癥因子水平的關(guān)聯(lián)。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 收集2016年7月—2018年6月筆者醫(yī)院就診的銀屑病患者204例，男性122例，女性82例，年齡(46.4±12.4)歲(34～58.8歲)，體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)為(23.6±4.1)kg/m2(19.5～27.7 kg/m2)，病程、受累體表面積(body surface area, BSA)和銀屑病皮損面積及嚴(yán)重度指數(shù)(psoriasis area and severity index, PASI) 中位數(shù)分別為10.0年(5.0～14.8)年、19.0%(16.0%～22.0%)和8.4(6.8～12.1)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)按照《中國(guó)臨床皮膚病學(xué)》中銀屑病的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為銀屑病[7]；(2)年齡>18歲；(3)同意鉆取皮膚病變組織及附近非病變組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：除銀屑病以外別的皮膚炎癥疾病，或伴隨其他系統(tǒng)性免疫疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡。所有銀屑病患者均位于進(jìn)展期，其中尋常型181例、關(guān)節(jié)型12例、局限性膿皰型6例及紅皮型5例。共有186例(91.2%)，172例(84.3%)，140例(68.6%)和22例(10.8%)患者正在接受局部治療、光療、系統(tǒng)性非生物制劑治療和系統(tǒng)性生物制劑治療。本研究獲得筆者醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入研究的患者均簽署知情同意書。

1.2數(shù)據(jù)收集 患者納入研究后，記錄患者的年齡、性別、BMI、病程、銀屑病受累BSA并評(píng)估PASI評(píng)分；此外，記錄患者正在使用的藥物類型以排除藥物對(duì)lncRNA NEAT1水平的影響。

1.3標(biāo)本獲取及保存 患者納入研究后，鉆取3 mm深度銀屑病病變組織標(biāo)本，并同時(shí)鉆取病變5 cm外的配對(duì)正常皮膚組織標(biāo)本，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)檢測(cè) 采用qPCR檢測(cè)病變組織及配對(duì)正常皮膚組織的lncRNA NEAT1表達(dá)量，并檢測(cè)病變組織標(biāo)本的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)、IL-8、IL-17和IL-22 mRNA的表達(dá)量。qPCR具體操作如下：采用TRIzol (美國(guó)Invitrogen公司)提取組織總RNA后，采用PrimeScript RT reagent (日本Takara公司)進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄，采用One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (日本Takara公司)進(jìn)行qPCR定量檢測(cè)。以GAPDH作為內(nèi)參，并采用2-△△Ct法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 qPCR引物設(shè)計(jì)

lncRNA：長(zhǎng)鏈非編碼RNA；NEAT1：核富集轉(zhuǎn)錄物1；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細(xì)胞介素.

2 結(jié) 果

2.1lncRNA NEAT1的表達(dá)量 lncRNA NEAT1的表達(dá)量在正常皮膚組織和病變皮膚組織中的中位值分別為1.442(0.667～2.324)和3.014(1.498～4.960)。與正常皮膚組織比較，lncRNA NEAT1表達(dá)量在病變組織中明顯偏高(P<0.001，圖1A)。用于鑒別銀屑病病變皮膚組織和正常皮膚組織的ROC曲線下面積(area under curve, AUC)為0.747(95%CI：0.700～0.794)，以最佳切割點(diǎn)lncRNA NEAT1的表達(dá)量2.077為閾值時(shí)(最佳切割點(diǎn)定義為敏感度和特異度之和最大的點(diǎn))，區(qū)別銀屑病病變皮膚組織和正常皮膚組織的敏感度為66.7%，特異度為72.5%(圖1B)，表明lncRNA NEAT1的表達(dá)量可以很好地區(qū)分銀屑病病變皮膚組織和正常皮膚組織。

2.2lncRNA NEAT1表達(dá)量與患者臨床特征的關(guān)聯(lián) 銀屑病患者病變皮膚組織lncRNA NEAT1表達(dá)量與PASI評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.275,P<0.001,表2)。此外，病變皮膚組織lncRNA NEAT1的表達(dá)量與患者年齡、性別、BMI、病程、受累BSA和治療方式均無關(guān)(表2，3)。進(jìn)一步分析不同銀屑病分型與長(zhǎng)鏈非編碼RNA NEAT1的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA NEAT1與不同銀屑病分型無顯著差異(P=0.094，表4)。

2.3PASI評(píng)分的關(guān)聯(lián)因素分析 采用單元線性回歸分析PASI評(píng)分的關(guān)聯(lián)因素，結(jié)果顯示病變皮膚組織lncRNA NEAT1表達(dá)量(P=0.001)、年齡(P=0.014)、受累BSA(P<0.001)和局部治療(P=0.005)均與PASI評(píng)分呈正相關(guān)。進(jìn)一步采用多元線性回歸模型分析PASI評(píng)分的關(guān)聯(lián)因素，結(jié)果顯示病變皮膚組織lncRNA NEAT1(P=0.014)、受累BSA(P<0.001)和局部治療(P=0.008)均與PASI呈獨(dú)立正相關(guān)。其他臨床病理特征和PASI評(píng)分的關(guān)聯(lián)詳見表5。

表2 病變皮膚組織lncRNA NEAT1表達(dá)量和患者臨床特征(連續(xù)變量)的關(guān)聯(lián)

Tab 2 Association between lncRNA NEAT1 relative expression in psoriatic lesions and clinical characteristics (continuous variable) of psoriatic patients

臨床特征(連續(xù)變量)lncRNA NEAT1表達(dá)量rP年齡0.072BMI0.058病程0.038受累BSA0.111PASI評(píng)分0.275<0.001

lncRNA：長(zhǎng)鏈非編碼RNA；NEAT1：核富集轉(zhuǎn)錄物1；BMI：體質(zhì)量指數(shù)；BSA：體表面積；PASI：銀屑病皮損面積及嚴(yán)重度指數(shù).

2.4lncRNA NEAT1表達(dá)量與炎癥因子mRNA表達(dá)量的關(guān)聯(lián) 病變組織炎癥因子TNF-α，IL-6，IL-8，IL-17和IL-22 mRNA的表達(dá)量分別為2.223(1.417～2.985),1.736(1.086～2.521),2.529(1.504～3.750),2.397(1.610～3.417)和2.782(1.642～4.220)。銀屑病患者病變皮膚組織lncRNA NEAT1的表達(dá)量與TNF-α mRNA(r=0.342，P<0.001)、IL-6 mRNA(r=0.315，P<0.001)、IL-8 mRNA(r=0.174，P=0.013)、IL-17 mRNA(r=0.345，P<0.001)和IL-22 mRNA(r=0.146，P=0.037)表達(dá)量均呈正相關(guān)(表6)。

表3 病變皮膚組織lncRNA NEAT1表達(dá)量和患者臨床特征(分類變量)的關(guān)聯(lián)

Tab 3 Association of lncRNA NEAT1 relative expression in psoriatic lesions with clinical characteristics (classified variable) of psoriatic patients

臨床特征(分類變量)lncRNA NEAT1表達(dá)量性別 女3.470(2.029～5.630) 男2.658(1.185～4.763)局部治療 無2.727(1.517～4.724) 有3.068(1.482～4.969)光療 無3.678(1.652～5.942) 有2.942(1.302～4.889)系統(tǒng)性非生物制劑治療 無3.338(1.743～5.262) 有2.893(1.302～4.889)系統(tǒng)性生物制劑治療 無2.931(1.445～5.103) 有3.544(1.646～4.592)

3 討 論

lncRNA NEAT1是從染色體11q13.1轉(zhuǎn)錄而來的，它含有兩種單體形式，分別是NEATI-1(3.7 kb)和NEATI-2(23 kb)，且被認(rèn)為是病毒誘導(dǎo)的非編碼RNA[8-12]。最近的研究表明，lncRNA NEAT1與多種免疫性和炎癥性疾病的生物學(xué)活動(dòng)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1 在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中通過調(diào)節(jié)絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的下游，促進(jìn)Toll樣受體(TLR4)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過程[6]。另一研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1在骨關(guān)節(jié)炎中滑膜細(xì)胞增生過程中可以抑制miR-181c的表達(dá)，從而促進(jìn)骨橋蛋白表達(dá)和滑膜細(xì)胞增生，骨橋蛋白再參與調(diào)節(jié)多種促炎因子(例如IL-6和IL-8)的表達(dá)[5]。此外，lncRNA NEAT1還被發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化中受低密度脂蛋白誘導(dǎo)，參與亞核結(jié)構(gòu)paraspeckle的形成，繼而paraspeckle通過核因子(nuclear factor-κB，NF-κB)和 p38 信號(hào)通路，參與巨噬細(xì)胞主導(dǎo)的炎癥和脂質(zhì)的攝取[13]。以上研究表明，lncRNA NEAT1間接或直接調(diào)控炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)了免疫性或炎癥性疾病的發(fā)生或進(jìn)展過程。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在骨關(guān)節(jié)炎患者退化的滑膜組織中，lncRNA NEAT1 被發(fā)現(xiàn)表達(dá)量上調(diào)[5]。此外，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血液?jiǎn)魏思?xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1也高表達(dá)，且與疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)[6]。鑒于銀屑病是以高度炎癥為特征的自身免疫性皮膚病，筆者假設(shè)lncRNA NEAT1也與銀屑病的發(fā)病機(jī)理和進(jìn)展過程有關(guān)。因此，筆者比較了銀屑病患者病變皮膚組織和配對(duì)正常皮膚組織中l(wèi)ncRNA NEAT1的表達(dá)量，結(jié)果表明lncRNA NEAT1在銀屑病患者病變皮膚組織中的表達(dá)量明顯高于正常皮膚組織，且ROC曲線結(jié)果顯示lncRNA NEAT1高表達(dá)可以用來很好地區(qū)分銀屑病病變皮膚組織和正常皮膚組織。關(guān)聯(lián)分析表明，lncRNA NEAT1表達(dá)量和銀屑病疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)，進(jìn)一步的多元線性回歸分析表明病變皮膚組織lncRNA NEAT1表達(dá)量與疾病活動(dòng)度呈獨(dú)立正相關(guān)。這些結(jié)果可能的原因是：(1)lncRNA NEAT1可能在真皮層自體免疫細(xì)胞中通過結(jié)合核內(nèi)蛋白PSPC1、SFPQ或p54nrb組成paraspeckle結(jié)構(gòu)，繼而paraspeckle通過多種炎癥通路(如MAPK、NF-κB)促進(jìn)真皮層自體免疫細(xì)胞分泌多種炎癥因子(包括TNF-α，IL-6，IL-8 和IL-1β等)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，因而臨床表現(xiàn)為銀屑病的活動(dòng)度更高；(2)lncRNA NEAT1可能直接參與調(diào)控炎癥反應(yīng)相關(guān)通路，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，使銀屑病患者的疾病活動(dòng)度升高[5-6,13-15]。

表4 不同銀屑病分型和病變組織lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量的關(guān)聯(lián)

lncRNA：長(zhǎng)鏈非編碼RNA； NEAT1：核富集轉(zhuǎn)錄物1； BMI：體質(zhì)量指數(shù)；BSA：體表面積.

表5 PASI評(píng)分的關(guān)聯(lián)因素(線性回歸分析)

Tab 5 Factors affecting PASI score by linear regression analysis

炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量rPTNF-α mRNA0.342<0.001IL-6 mRNA0.315<0.001IL-8 mRNA0.1740.013IL-17 mRNA0.345<0.001IL-22 mRNA0.1460.037

PASI：銀屑病皮損面積及嚴(yán)重度指數(shù)； lncRNA：長(zhǎng)鏈非編碼RNA； NEAT1：核富集轉(zhuǎn)錄物1；IL：白細(xì)胞介素;TNF-α：腫瘤壞死因子-α.

表6 病變皮膚組織lncRNA NEAT1表達(dá)量和炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的關(guān)聯(lián)

Tab 6 Association between lncRNA NEAT1 relative expression of psoriatic lesions and relative expression of inflammatory cytokine mRNA

炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量lncRNA NEAT1相對(duì)表達(dá)量rPTNF-α mRNA0.342<0.001IL-6 mRNA0.315<0.001IL-8 mRNA0.1740.013IL-17 mRNA0.345<0.001IL-22 mRNA0.1460.037

lncRNA：長(zhǎng)鏈非編碼RNA；NEAT1：核富集轉(zhuǎn)錄物1；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細(xì)胞介素.

文獻(xiàn)報(bào)道，TNF-α，IL-6，IL-8，IL-17和IL-22與銀屑病疾病進(jìn)展非常相關(guān)[3,16]。因此，為進(jìn)一步確定lncRNA NEAT1與銀屑病炎癥的關(guān)系，本研究檢測(cè)了銀屑病患者病變皮膚組織中TNF-α，IL-6，IL-8，IL-17和IL-22水平，并與lncRNA NEAT1在病變皮膚組織中表達(dá)量做關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示病變皮膚組織中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)水平與TNF-α，IL-6，IL-8，IL-17和IL-22水平呈正相關(guān)，表明lncRNA NEAT1可能是通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)來加重患者的疾病活動(dòng)度，這可能與其在系統(tǒng)性紅斑狼瘡或動(dòng)脈粥樣硬化中的促炎作用類似。lncRNA NEAT1通過直接調(diào)控炎癥反應(yīng)相關(guān)通路，如誘導(dǎo)MAPK途徑激活來促進(jìn)TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過程，從而誘導(dǎo)促炎因子的表達(dá)。此外，lncRNA NEAT1也可以通過形成paraspeckle，間接參與調(diào)控炎癥反應(yīng)相關(guān)通路，比如NF-κB或 p38，繼而誘導(dǎo)促炎因子的表達(dá)[5-6,14-16]。

本研究不足之處：(1) 未深入評(píng)估lncRNA NEAT1影響銀屑病患者炎癥水平和疾病活動(dòng)度的機(jī)制；(2) 研究樣本來自單中心且樣本量較小，可能造成患者選擇偏倚和統(tǒng)計(jì)效能下降；(3) 未評(píng)估lncRNA NEAT1在銀屑病患者轉(zhuǎn)歸中的作用。