光交聯(lián)絲素蛋白水凝膠的藍光引發(fā)體系

孫廣東， 黃 益， 邵建中， FAN Qinguo

(1. 浙江理工大學 生態(tài)染整技術教育部工程研究中心， 浙江 杭州 310018； 2. 麻省大學達特茅斯分校 生物工程系， 馬薩諸塞州 北達特茅斯 02747)

蠶絲具有色澤光鮮、天然無毒、性能優(yōu)異等特點，廣泛應用于紡織、食品加工等領域。針對其組成和結構的研究已長達50年，其主要成分的研究近年來已較為成熟。蠶絲的主要成分是絲素蛋白(SF)，約占蠶絲總成分的 75%～80%[1]。絲素蛋白是一種天然的高分子蛋白質(zhì)，具有優(yōu)異的生物相容性、可降解性等。得益于其良好的物化性能，絲素蛋白被廣泛應用于紡織品、食品、化妝品等領域，并不斷向生物醫(yī)學等多個領域拓展[2-3]。目前生物醫(yī)用蠶絲蛋白材料是指再生絲蛋白(RSF)，是由蠶絲溶解獲得的蛋白質(zhì)。絲素蛋白水凝膠具有特定的有序結構，可調(diào)的力學性能，低免疫原性、生物降解性和類細胞外基質(zhì)結構，是組織工程支架、醫(yī)用紡織品、生物傳感器等材料的良好選擇[4]。

常規(guī)的絲素蛋白水凝膠主要是通過加入醇類、表面活性劑[5]，改變溫度、濃度、pH值、輻照條件、離子強度(包括鈣離子、鉀離子等)或者超聲、剪切處理等[6-8]條件促進絲素蛋白分子發(fā)生構象轉變[9-11]，或通過加入化學交聯(lián)劑[12-14](如戊二醛、酪氨酸酶、京尼平等)實現(xiàn)絲素蛋白鏈與交聯(lián)劑間的共價鍵交聯(lián)，從而構建三維的高分子凝膠網(wǎng)絡。然而上述方法往往難以同時滿足絲素蛋白水凝膠對生物活性、凝膠效率及凝膠強度的要求，限制了其進一步的應用。如何高效、安全地制備高強度絲素蛋白水凝膠，對開發(fā)人造皮膚/器官等高端醫(yī)用紡織品、新型組織工程支架等具有重要意義。

將光交聯(lián)技術與絲素蛋白水凝膠相結合，可實現(xiàn)絲素蛋白水凝膠的高效可控制備。研究者通過化學改性制備了可光交聯(lián)的丙烯酸酯化[15]或降冰片烯功能化[16]的絲素蛋白大分子，經(jīng)自由基光聚合/巰基烯反應實現(xiàn)了絲素蛋白化學凝膠的高效制備。2003年，核黃素(維生素B2)在370 nm紫外線下與絲素蛋白光偶合交聯(lián)(二酪氨酸)制備膠原蛋白水凝膠，并首次應用于圓錐角膜的治療[17]，該研究工作無需對絲素蛋白進行化學改性。Applegate等[18]以核黃素為光引發(fā)劑在紫外光/可見光下實現(xiàn)透明、有彈性的絲蛋白水凝膠的制備，并用于圓錐角膜的修復，有望實現(xiàn)無風險的視力矯正，以減輕永久性手術并發(fā)癥；但該方法制備的絲素蛋白水凝膠普遍存在凝膠時間(>30 min)長、凝膠強度(<100 Pa)低等問題，存在極大的局限性。此外，高能量紫外光易使具有生物活性的復合物質(zhì)(細胞、DNA、蛋白質(zhì)等)失活，同時存在固化深度淺、輻射和臭氧污染等問題，因此，有必要開發(fā)能量較高、溫和的絲素蛋白水凝膠的可見光交聯(lián)技術。

相較于紫外光和其他可見光，誕生于20世紀90年代的藍光LED是一種較安全、高能的低溫光源，具有安全和能量利用率高的顯著優(yōu)勢。作為一種新型的可見光聚合技術，藍光聚合最早應用于齒科填充領域。目前在生物醫(yī)藥、數(shù)碼印花、3D打印等[19-21]領域均有應用。為實現(xiàn)高強度絲素蛋白水凝膠的快速安全制備，本文以4種生物相容性良好的光引發(fā)劑(樟腦醌(CQ)、核黃素磷酸鈉(FMN)、曙紅Y(EY)及姜黃素(CC))以及光敏增效劑(二苯基碘鎓六氟磷酸鹽(DPI))為研究對象，對其光譜吸收特性及藍光引發(fā)性能進行研究，在此基礎上探明藍光引發(fā)絲素蛋白光交聯(lián)反應的機制，并高效、安全地制備再生絲素蛋白水凝膠。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

樟腦醌、核黃素磷酸鈉、曙紅Y、姜黃素、二苯基碘鎓六氟磷酸鹽、丙烯酰胺(AM)，分析純，美國Sigma Aldrich公司；生絲坯布，面密度為65 g/m2，杭州萬事利絲綢文化股份有限公司；纖維素透析袋，36 mm，截留分子質(zhì)量為8 000～14 000 u，上海聯(lián)碩生物科技有限公司。

1.2 實驗儀器

Lambda-950型紫外-可見分光光度計(美國Perkinelmer公司)；Q2000型Photo-DSC光量熱系統(tǒng)(美國TA公司)；MCR52型旋轉流變儀(奧地利Anton Paar公司)；藍光LED(100 W，實驗室自制)。

1.3 實驗方法

1.3.1 絲素蛋白的溶解與濃縮

首先將生絲(已脫膠)坯布剪碎，分批加入CaCl2-CH3CH2OH-H2O三元體系(量比為1∶2∶8)中，浴比為1∶20，升溫至70 ℃，振蕩攪拌溶解約 3 h。將上述溶解體系冷卻至室溫后，轉移至纖維素透析袋中，置于去離子水中透析處理3～4 d(第1天時每2 h換一次水)。將上述透析液進行離心處理(10 000 u， 20 min，25 ℃)，即得到質(zhì)量分數(shù)為2.5%的絲素蛋白溶液。

將絲素蛋白溶液置于纖維素透析袋中，轉移至質(zhì)量分數(shù)為30%的聚乙烯吡咯烷酮(分子質(zhì)量為 10 000 u)溶液中進行透析濃縮處理約24 h，即可得到質(zhì)量分數(shù)為8.5%的絲素蛋白溶液。

1.3.2 光交聯(lián)絲素蛋白水凝膠的制備

準確稱取一定質(zhì)量分數(shù)(與絲素蛋白相比)的光引發(fā)劑(光敏增效劑)，然后加入絲素蛋白溶液后避光攪拌至均勻溶解，得到絲素蛋白前驅(qū)液。將上述前驅(qū)液轉移至模具內(nèi)，在氮氣氛圍內(nèi)于467 nm藍光LED的照射下反應一定時間，即得到絲素蛋白水凝膠。

1.4 性能測試與表征

1.4.1 光引發(fā)劑的藍光聚合性能測試

首先配置質(zhì)量分數(shù)為30%的丙烯酰胺溶液，然后分別稱取質(zhì)量分數(shù)為0.5%的光引發(fā)劑(相對于丙烯酰胺質(zhì)量)，經(jīng)超聲溶解至均一后，即得到可藍光聚合的丙烯酰胺前驅(qū)體。

采用Photo-DSC光量熱系統(tǒng)在恒溫(25 ℃)模式下對不同前驅(qū)體的藍光聚合反應熱流變化進行實時記錄。準確稱取7～8 mg的水凝膠聚合前驅(qū)液于敞口Tzero鋁盤中，同時放置空盤作為參比樣。通過400～500 nm的帶通濾光片和10%衰減濾光片對200 W水銀弧光燈光源進行過濾，得到一定強度的藍光輻照光源，并通過2路光纖導入DSC爐內(nèi)作為引發(fā)光源(19 mW/cm2)。為避免氧阻聚現(xiàn)象的發(fā)生，在輻照前5 min通入流速為50 mL/min的超純氮氣以隔絕空氣。根據(jù)下式可計算光聚合速率Rp和雙鍵轉化率C[22]。

式中：ΔHt為t時刻內(nèi)的聚合反應熱焓，kJ/mol；ΔHm為完全反應的理論熱焓，對于丙烯酸類單體雙鍵，ΔHm=86 kJ/mol。

1.4.2 藍光引發(fā)劑及光交聯(lián)絲素蛋白光譜吸收特性

采用紫外-可見分光光度計測試4種不同的光引發(fā)劑及光交聯(lián)絲素蛋白的光譜吸收特性。

分別將4種光引發(fā)劑溶解于無水乙醇中，配制成1×10-5mol/L核黃素磷酸鈉、姜黃素及曙紅Y的乙醇溶液與1.5×10-2mol/L樟腦醌的乙醇溶液。測試上述光引發(fā)劑溶液在200～600 nm內(nèi)的光譜吸收特性。

分別配制絲素蛋白溶液(質(zhì)量分數(shù)1%)、絲素蛋白(質(zhì)量分數(shù)1%)-曙紅Y溶液(濃度為 2 mmol/L) 2種樣品，測試上述體系在200～800 nm內(nèi)的光譜吸收特性。將上述絲素蛋白-曙紅Y溶液置于467 nm藍光LED的照射下分別反應20、40 min 后，測試其光譜吸收特性。

1.4.3 水凝膠聚合前驅(qū)液的藍光流變行為測試

采用旋轉流變儀與光量熱單元(PCA)組成光流變系統(tǒng)，在振蕩模式下對絲素蛋白前驅(qū)液藍光聚合過程中的動態(tài)模量進行測試。選用CP50錐平板在 0.1 mm 間距、10%振幅及10 Hz頻率的條件下，對水凝膠聚合前驅(qū)液進行掃描，在30 s避光掃描后啟動藍光輻照(19.0 mW/cm2)。由于絲素蛋白發(fā)生凝膠化反應時，隨著光照的進行，其儲能模量G′經(jīng)歷了一個較大幅度的上升過程，而損耗模量G″變化不大，損耗因子tanδ呈下降趨勢，故定義凝膠點及凝膠時間tgel為儲能模量G′與損耗模量G″交叉點及其出現(xiàn)的時間。

2 結果與討論

2.1 光引發(fā)劑的光譜吸收特性

CQ、FMN、CC、EY這4種化合物在生物、醫(yī)學、化工、食品等領域均具有廣泛應用。從分子結構上看，4種化合物分子中存在共軛雙鍵，具有剛性的平面構造和發(fā)生氧化還原反應的位點，所以具有很好的光化學活性，共軛雙鍵的n-π*躍遷使之對藍光具有選擇性的吸收。4種光引發(fā)劑在200～600 nm區(qū)域內(nèi)的光譜吸收特性如圖1所示?？芍?，CQ、FMN、CC以及EY的乙醇溶液在可見光區(qū)域均存在吸收，其最大可見光吸收波長分別為465、446、426及515 nm。本文實驗采用的藍光光源為最大發(fā)射光波長為467 nm的藍光LED，幾種光引發(fā)劑在藍光區(qū)域(400～450 nm)均有吸收，且均與藍光LED的發(fā)射光波區(qū)域有重疊。

圖1 4種藍光引發(fā)劑的光譜特性Fig.1 Spectral characteristics of four blue light. (a) UV-Vis absorption spectra of FMN, CC and EY in ethanol; (b) UV-Vis absorption spectra of CQ in ethanol

與此同時，4種化合物還具有光敏特性，是重要的光敏化試劑，在光照條件下可發(fā)生光致化學反應。為驗證該光敏特性，對4種溶液進行藍光輻照實驗，并測試輻照后的紫外-可見吸收光譜，結果如圖2 所示?？芍?，樟腦醌乙醇溶液在455 nm處的光譜吸收峰隨藍光輻照后發(fā)生明顯下降，而在288 nm處產(chǎn)生新峰并不斷升高。這是因為光引發(fā)劑的共軛結構會在光解反應過程中遭到破壞，使其在可見光區(qū)的吸收不斷降低，同時在紫外區(qū)產(chǎn)生的新光解產(chǎn)物的吸收峰，在宏觀上表現(xiàn)出“光漂”現(xiàn)象[23]。4種化合物均出現(xiàn)了光漂現(xiàn)象，其中曙紅Y最為明顯。

圖2 藍光引發(fā)劑的光敏特性Fig.2 Photosensitivity of blue light. (a) UV-Vis absorption spectra of camphorquinone under different blue light irradiation time; (b) Blue light bleaching properties of four photoinitiators

圖3 不同光引發(fā)體系引發(fā)AM聚合的藍光聚合效率Fig.3 Blue photopolymerization efficiency of AM initiated by different photoinitiation systems. (a) Heat flow of AM photopolymerized by different photoinitiators; (b) Double bond conversion of AM photopolymerized by different photoinitiators; (c) Heat flow of AM photopolymerized by photoinitiator/DPI system; (d) Double bond conversion of AM photopolymerized by photoinitiator/DPI system

2.2 光引發(fā)劑的藍光聚合性能

根據(jù)4種化合物的光化學特性，研究者將其作為紫外光或可見光引發(fā)劑用于光固化樹脂涂層、感光膠、臨床應用等方面，并取得了一定研究成果[24-26]。除樟腦醌外，其他光引發(fā)劑作為藍光引發(fā)劑的研究還較少。為進一步研究上述光引發(fā)劑的藍光引發(fā)效率，以質(zhì)量分數(shù)為30%的丙烯酰胺(AM)為水溶性活性單體，以光聚合速率、雙鍵轉化率為考察指標，測試不同光引發(fā)劑的藍光引發(fā)效率，結果如圖3所示。

由圖3(a)、(b)可知，4種光引發(fā)劑均可引發(fā)AM光聚合反應，但藍光引發(fā)速率(< 0.5 W/g)、雙鍵轉化率(< 20%)均普遍較低，即4種光引發(fā)劑在水溶液中單獨引發(fā)活性單體光聚合反應的效率極低，難以滿足實驗要求，需要開發(fā)提高藍光聚合效率的新方法。

有研究報道將芳基碘(/硫)鎓鹽作為光敏增效劑引入樟腦醌/胺體系組成三組分藍光引發(fā)體系，可顯著提升藍光聚合效率。在本文研究中，選用二苯基碘鎓六氟磷酸鹽(DPI)作為光敏增效劑與光引發(fā)劑組成二組分藍光引發(fā)體系改善其光引發(fā)效率。由圖3(c)可知，引入DPI后，EY、CQ這2種光引發(fā)劑的聚合速率得到明顯提高，尤其EY藍光引發(fā)速率提高了40倍以上，而FMN和CC體系的引發(fā)效率無明顯變化。上述現(xiàn)象表明：光敏增效劑DPI的加入可有效提高部分光引發(fā)劑的藍光引發(fā)效率。由圖3(d)雙鍵轉化率可知，當存在DPI時，EY、CQ的最終轉化率高于FMN、CC體系，且可在短時間達到最終轉化率，其中EY達到最終轉化率的時間為 65 s 左右，此時的轉化率約為16%。

CQ/DPI光引發(fā)體系的光引發(fā)機制如圖4所示。作為Norrish II型(奪氫型)自由基聚合光引發(fā)劑，CQ吸收光能后，可由基態(tài)轉化為激發(fā)態(tài)CQ*，該激發(fā)態(tài)CQ*難以單獨引發(fā)單體聚合反應。DPI可通過將激發(fā)態(tài)CQ*還原成自由基CQ·的同時產(chǎn)生活性苯基自由基，從而引發(fā)單體光聚合反應，顯著提升自由基光聚合效率。

圖4 CQ/DPI雙組分光引發(fā)體系的引發(fā)機制Fig.4 Photoinitiation mechanism of CQ/DPI initiation system

2.3 絲素蛋白水凝膠的藍光交聯(lián)機制

上述藍光引發(fā)體系可用于光交聯(lián)絲素蛋白水凝膠的制備。采用紫外-可見光譜對曙紅Y引發(fā)絲素蛋白光交聯(lián)反應的機制進行研究，其對應的紫外-可見光譜曲線如圖5所示。在SF/EY體系中，由于曙紅Y的存在，在517 nm處出現(xiàn)了特征吸收峰，隨著光照的進行，絲素蛋白溶液顏色發(fā)生明顯變化，且517 nm處曙紅Y特征吸收峰消失，表明其發(fā)生了光化學反應。與此同時，在313 nm處出現(xiàn)了雙酪氨酸結構的特征吸收峰。結合其他相關研究推斷，絲素蛋白光交聯(lián)結構主要是通過相鄰酪氨酸殘基間的偶合作用生成雙酪氨酸結構實現(xiàn)的。

圖5 曙紅Y光交聯(lián)絲素蛋白體系的 紫外-可見光譜曲線Fig.5 UV-Vis spectra of EY photocrosslinked silk fibroin

絲素蛋白水凝膠可能的光交聯(lián)機制如圖6所示。可知，光引發(fā)劑在藍光的激發(fā)下形成分子激發(fā)態(tài)，與酪氨酸殘基酚羥基鄰位氫原子間發(fā)生電子轉移形成自由基，相鄰酪氨酸殘基自由基經(jīng)偶合生成雙酪氨酸結構，從而實現(xiàn)絲素蛋白大分子鏈間的化學交聯(lián)。

圖6 絲素蛋白光交聯(lián)反應及交聯(lián)機制Fig.6 Photocrosslinking reaction and mechanism for silk fibroin

2.4 藍光交聯(lián)絲素蛋白水凝膠的凝膠特性

絲蛋白水凝膠的流變行為和力學性能是決定其應用的重要性能指標。在探明上述絲素蛋白光交聯(lián)機制的基礎上，深入探究光引發(fā)體系對絲素蛋白水凝膠光流變性能的影響，測試結果如圖7所示。

圖7 不同光引發(fā)體系下光交聯(lián)絲素蛋白水凝膠的彈性模量、凝膠時間及損耗因子測試結果Fig.7 Storage modulus, gel time and loss factor of photocrosslinked fibroin hydrogels under different photoinitiator systems. (a) Storage modulus without DPI; (b) Loss factor without DPI; (c) Storage modulus with DPI; (d) Loss factor with DPI; (e) Gel time

絲素蛋白的凝膠化反應表現(xiàn)為由黏性液態(tài)向彈性凝膠態(tài)轉變，凝膠點為該過程的轉變點，可用于描述光交聯(lián)絲素蛋白凝膠化進程。由圖7(a)、(b)可知，相同質(zhì)量分數(shù)的光引發(fā)劑下光交聯(lián)絲素蛋白水凝膠的儲能模量(<100 Pa)普遍較低，且相差不大，凝膠點出現(xiàn)的時間均較長，分別為：tgel(CQ)= 1 312 s，tgel(CC)=1 058 s，tgel(EY)=870 s，tgel(RF)=733 s，tgel(FMN)=333 s。表明光引發(fā)劑單獨引發(fā)交聯(lián)絲素蛋白的效率較低。

由2.3節(jié)已知，通過引入光敏增效劑DPI可大幅度提高光引發(fā)劑的藍光聚合效率，因此，通過研究光引發(fā)劑/光敏增效劑雙組分光引發(fā)體系引發(fā)絲素蛋白光交聯(lián)反應的效率。由圖7(c)～(e)可知，DPI對光交聯(lián)絲素蛋白水凝膠的儲能模量影響較大，在500 s光照后，CQ、EY體系均表現(xiàn)出較高的凝膠強度(>100 Pa)，凝膠點出現(xiàn)時間大幅縮短(tgel(CC)=786 s，tgel(FMN)=429 s，tgel(CQ)=200 s，tgel(EY)=97 s，其中EY/DPI體系的凝膠點出現(xiàn)的時間最短，約為97 s。

圖8示出光交聯(lián)絲素蛋白水凝膠的制備過程?？芍涸跓oDPI存在的情況下，絲素蛋白前驅(qū)液經(jīng)藍光輻照40 min后表現(xiàn)出凝膠現(xiàn)象， 但凝膠強度較低，難以形成穩(wěn)定的結構。

注：(a)、(b)、(c)樣品中含有的光引發(fā)劑從右向左依次為無引發(fā)劑、樟腦醌、核黃素磷酸鈉、姜黃素、曙紅Y。圖8 光交聯(lián)絲素蛋白水凝膠的制備過程Fig.8 Preparation process of photocrosslinked silk fibroin hydrogel. (a) Silk fibroin precursor before illumination; (b) Without DPI by illuminating blue light for 40 min; (c) With DPI by illuminating blue light for 10 min; (d) Silk fibroin hydrogel photoinitiated by photoinitiators for 10 min

由圖8(c)可知，當DPI存在時，絲素蛋白前驅(qū)液只需光照10 min即可得到較穩(wěn)定的絲素蛋白水凝膠結構,其中以EY/DPI、CQ/DPI為藍光引發(fā)體系可制得具有較高力學強度的完整水凝膠樣品，表明該藍光引發(fā)體系的光交聯(lián)性能更高。

在上述體系中，基于DPI對絲素蛋白的光交聯(lián)反應具有明顯的增效作用，提出了二組分光引發(fā)體系引發(fā)絲素蛋白光交聯(lián)反應可能的機制。激發(fā)態(tài)光引發(fā)劑(PI*)從絲素蛋白分子上的酪氨酸殘基(TH)中提取H原子并形成酪氨酸自由基(T·)和光引發(fā)劑自由基(PI-·)，2個相鄰的酪氨酸自由基經(jīng)偶合作用形成雙酪氨酸結構實現(xiàn)共價交聯(lián)。與此同時，光引發(fā)劑自由基(PI-·)還會與DPI反應生成光引發(fā)劑分子和其他活性自由基(苯基自由基)，從而減緩了光引發(fā)劑的消耗，同時還提高了活性自由基的含量，具體方式如下：

PI*+TH→PI-·+T·+H·

PI-·+DPI→PI+X·

T·+T·→T-T

3 結 論

本文研究了4種光引發(fā)劑的藍光引發(fā)機制、引發(fā)性能及引發(fā)絲素蛋白光交聯(lián)反應的可能機制，在此基礎上提出了一種絲素蛋白水凝膠的安全高效制備方法。

1)與其他光引發(fā)劑相比，樟腦醌和曙紅Y表現(xiàn)出更佳的藍光聚合性能，與二芳基六氟磷酸碘鎓鹽(DPI)組成雙引發(fā)體系可大幅提升光引發(fā)聚合效率，可作為引發(fā)絲素蛋白光交聯(lián)反應的藍光引發(fā)劑。

2)通過藍光激發(fā)光引發(fā)劑引發(fā)絲素蛋白分子鏈上形成酪氨酸自由基，進而在相鄰鏈上偶合成雙酪氨酸結構，從而實現(xiàn)絲素蛋白分子的共價交聯(lián)。

3)相比于單一體系光引發(fā)劑，光引發(fā)劑/DPI二組分體系通過提高光引發(fā)劑與活性自由基的含量，可大幅提高光交聯(lián)反應的效率，從而縮短光交聯(lián)絲素蛋白水凝膠的凝膠時間(約97 s)，同時提高絲素蛋白凝膠強度。