自噬調(diào)節(jié)高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

馬濟(jì)遠(yuǎn)，葉 巍，李 吉，裴 瑞，何夢(mèng)梅，蘇靜波，孫董潔，周其武，周 健

目的：探究自噬水平變化對(duì)高糖誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響及其機(jī)制。

方法：人晶狀體上皮細(xì)胞(HLE-B3)分為正常對(duì)照組(NC組)和高糖處理組(HG組)，分別用含5.5mmol/L葡萄糖的DMEM和添加了30mmol/L葡萄糖的上述DMEM培養(yǎng)12、24、48h，用Western blot檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白(E-cadherin、α-SMA)和自噬標(biāo)志蛋白(LC3、Beclin 1和SQSTM1/p62)的表達(dá)變化，用劃痕實(shí)驗(yàn)觀(guān)察細(xì)胞的移行能力以明確高糖對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞自噬和EMT的影響。利用雷帕霉素調(diào)節(jié)自噬水平，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組(NC組)、高糖處理組(HG組)，高糖處理細(xì)胞的同時(shí)添加DMSO溶劑組(DMSO組)和添加200nmol/L雷帕霉素的雷帕霉素組(RAPA組)，處理細(xì)胞24h，用Transwell實(shí)驗(yàn)觀(guān)察細(xì)胞的移行能力，用Western blot檢測(cè)EMT、自噬標(biāo)志蛋白和TGF-β信號(hào)通路蛋白(TGF-β2、Smad2/3、p-Smad2/3、Snail)的表達(dá)。用細(xì)胞免疫熒光染色觀(guān)察SQSTM1/p62與Smad2/3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，免疫共沉淀方法檢測(cè)細(xì)胞中SQSTM1/p62與Smad2/3之間的相互結(jié)合。

結(jié)果：在高糖刺激后12、24、48h，HG組細(xì)胞E-cadherin、LC3 Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1蛋白表達(dá)逐漸降低(F=67.52、163、206，均P<0.0001)，而α-SMA、SQSTM1/p62蛋白表達(dá)增加(F=53.37、302.1，均P<0.0001)，細(xì)胞移行也較NC組增加(均P<0.001)，提示高糖刺激后細(xì)胞發(fā)生EMT，而自噬水平降低；雷帕霉素處理后，與HG組和DMSO組相比，RAPA組LC3 Ⅱ/Ⅰ和E-cadherin蛋白表達(dá)水平增加，α-SMA、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3及Snail蛋白表達(dá)降低(均P<0.05)，TGF-β2表達(dá)無(wú)明顯改變(均P>0.05)，細(xì)胞移行被抑制(均P<0.001)，提示雷帕霉素在提高自噬水平的同時(shí)下調(diào)了TGF-β信號(hào)通路分子的表達(dá)進(jìn)而抑制了EMT。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示SQSTM1/p62與Smad2/3在胞漿內(nèi)存在共定位，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SQSTM1/p62與Smad2/3蛋白相互結(jié)合。

結(jié)論：高糖可刺激HLE-B3細(xì)胞發(fā)生EMT，下調(diào)細(xì)胞的自噬水平；自噬通過(guò)SQSTM1/p62與Smad2/3相互作用，改變了TGF-β信號(hào)通路中Smad2/3的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)EMT的調(diào)節(jié)。

0 引言

白內(nèi)障是糖尿病患者的眼部常見(jiàn)并發(fā)癥之一，其患白內(nèi)障的風(fēng)險(xiǎn)是普通人的2～5倍，且發(fā)生的年齡更早[1]、原因復(fù)雜，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在糖尿病白內(nèi)障的形成中起了重要作用[2-4]。自噬(autophagy)是一種維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞存活的基本細(xì)胞降解機(jī)制[5]。越來(lái)越多的研究表明自噬與EMT之間密切相關(guān)[6]，一方面，細(xì)胞依賴(lài)自噬激活后發(fā)生EMT而在受到外界刺激后得以存活，如在心肌細(xì)胞H9c2缺氧/復(fù)氧模型中發(fā)現(xiàn)高遷移率族1蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)通過(guò)增加盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體1(discoidin domain receptor 1，DDR1)的表達(dá)和抑制由哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的磷酸化激活的自噬而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT[7]；與此相反，另一方面自噬還有抑制腫瘤信號(hào)的作用，這阻礙了EMT過(guò)程，如沉默自噬相關(guān)蛋白Beclin 1和ATG7的表達(dá)可使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié)EMT的轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug的表達(dá)增高，從而增強(qiáng)這種細(xì)胞的EMT過(guò)程；然而，當(dāng)用饑餓和mTOR抑制劑激活細(xì)胞自噬時(shí)，細(xì)胞遷移和侵襲能力卻減弱[8]。

目前，對(duì)高濃度葡萄糖(簡(jiǎn)稱(chēng)高糖)刺激后人晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cell，HLEC)中自噬水平的變化情況，以及干預(yù)自噬后對(duì)EMT影響的相關(guān)研究還少有報(bào)道。本研究觀(guān)察了高糖環(huán)境下人晶狀體上皮細(xì)胞的自噬和EMT水平的變化，并觀(guān)察用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素改變自噬水平后對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞EMT的影響，探討自噬對(duì)EMT的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 永生化人晶狀體上皮細(xì)胞系HLE-B3獲自北京眼科研究所張偉教授饋贈(zèng)。HLE-B3細(xì)胞交由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行細(xì)胞系短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)鑒定，結(jié)果與收錄在DSMZ數(shù)據(jù)庫(kù)的SRA01/04細(xì)胞系完全匹配，SRA01/04細(xì)胞系為人類(lèi)晶狀體上皮細(xì)胞系，結(jié)果可證明本研究所用HLE-B3細(xì)胞為晶狀體上皮細(xì)胞。

1.1.2試劑 雷帕霉素(rapamycin)購(gòu)自美國(guó)Med Chem Express公司；蛋白酶抑制劑(No.539131)、磷酸酶抑制劑(No.524629)以及TGF-β2抗體(No.AEB586)均購(gòu)自美國(guó)EMD Millipore公司；LC3(No.12741)、E-cadherin(No.14472)、Smad2/3(No.8685)、p-Smad2(No.3108)、p-Smad3(No.9520)以及Snail(No.3879)抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；α-SMA(No.ab5694)、SQSTM1/p62(No.ab56416)以及Beclin 1(No.ab62557)抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；GAPDH(No.60004-1-Ig)抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體以及HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體均購(gòu)自中國(guó)武漢三鷹公司；Alexa Fluor 594標(biāo)記的驢抗兔IgG抗體和Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗小鼠IgG抗體均購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；含DAPI的抗熒光淬滅封片劑購(gòu)自西安赫特生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒以及IP裂解液均購(gòu)自中國(guó)上海碧云天公司；ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)北京ZETA公司；protein A/G磁珠購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.1.3儀器設(shè)備 Transwell小室(Millipore公司，美國(guó))，SDS-PAGE電泳儀、電泳槽及化學(xué)發(fā)光儀(Bio-Rad公司，美國(guó))，倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)，共聚焦顯微鏡(Olympus公司，日本)

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HLE-B3細(xì)胞培養(yǎng)在添加了10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的低濃度葡萄糖(5.5mmol/L)杜氏培養(yǎng)基(DMEM)中，并置于37℃的5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每2d更換1次培養(yǎng)基，細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合度后進(jìn)行傳代。在細(xì)胞長(zhǎng)至密度約為70%后，轉(zhuǎn)移至無(wú)血清培養(yǎng)基中饑餓2h后，高糖處理組(HG組)細(xì)胞更換添加了30mmol/L葡萄糖的DMEM(總葡萄糖濃度35.5mmol/L)中培養(yǎng)，而正常對(duì)照組(NC組)細(xì)胞仍用上述低濃度葡萄糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別在高糖處理前(0h)、處理后12、24、48h 觀(guān)察自噬和EMT相關(guān)指標(biāo)。在200nmol/L雷帕霉素干預(yù)高糖處理的HLE-B3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞分為4組，在原有的NC組和HG組基礎(chǔ)上，增加雷帕霉素組(RAPA組)和溶劑組(DMSO組)，即在高糖處理細(xì)胞的同時(shí)，用200nmol/L雷帕霉素和其等量的溶劑DMSO分別處理細(xì)胞24h，并觀(guān)察相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 Western blot實(shí)驗(yàn) 經(jīng)過(guò)處理的HLE-B3細(xì)胞，在棄去培養(yǎng)液之后用PBS清洗3遍，再加入1mL PBS并使用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，將含有細(xì)胞的PBS轉(zhuǎn)移至EP管中，在5000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min，棄去上清液后加入配置好的含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液120μL，經(jīng)過(guò)充分裂解和超聲粉碎后于4℃、12000r/min離心15min，吸取上清液。取20μL蛋白樣品用BCA法測(cè)定蛋白濃度。在剩余的100μL蛋白提取液中加入25μL 5×上樣緩沖液，于100℃金屬浴中加熱10min，冷卻到室溫。向電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度從每個(gè)樣本取30μg蛋白，上樣到配置好的8%或15%的SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，在Bio-Rad標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置上進(jìn)行電泳蛋白分離，再將分離的蛋白使用Bio-Rad標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置冰浴下轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。剩余的變性后蛋白置于-20℃冰箱中保存。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜3h，4℃下孵育相應(yīng)的一抗(稀釋濃度均為1∶1000)過(guò)夜。TBST漂洗PVDF膜3次，每次5min。再使用相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋濃度均為1∶3000)37℃孵育1h，TBST漂洗PVDF膜3次，每次5min。配置化學(xué)發(fā)光顯色液(A液∶B液=1∶1)，在Bio-Rad化學(xué)發(fā)光儀下進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，并獲得圖像。使用Image J軟件對(duì)相應(yīng)條帶灰度值進(jìn)行測(cè)量。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，確保過(guò)夜后細(xì)胞100%融合。次日使用1mL移液槍槍頭在6孔板內(nèi)筆直劃線(xiàn)，形成一條劃痕(原始劃痕)，然后用PBS清洗3次，洗去脫落的細(xì)胞。將劃痕處理后的細(xì)胞分別置于常規(guī)DMEM培養(yǎng)基(NC組)和含高糖的DMEM培養(yǎng)基(HG組)中培養(yǎng)，分別在0、12、24、48h于倒置顯微鏡下觀(guān)察并拍照劃痕(新劃痕)變化情況，每組隨機(jī)挑選3個(gè)視野。用Image J軟件標(biāo)記圖片中劃痕范圍并計(jì)算劃痕的面積。細(xì)胞遷移百分比(%)=(原始劃痕面積-新的劃痕面積)/原始劃痕面積×100%。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 將200μL HLE-B3細(xì)胞懸液接種于Transwell小室的上室(1×104/孔)，下室根據(jù)分組(NC組、HG組、DMSO組、RAPA組)分別添加相應(yīng)的培養(yǎng)基500μL，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將小室置于4%多聚甲醛中固定0.5h，小心拭去上室細(xì)胞，將小室用結(jié)晶紫染色15min。用PBS洗3次后在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞數(shù)量，隨機(jī)取5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光染色 將正常培養(yǎng)的HLE-B3細(xì)胞接種于放置細(xì)胞爬片的12孔板內(nèi)，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%時(shí)，吸除培養(yǎng)基，加入PBS浸洗細(xì)胞3次，每次5min。向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1mL固定細(xì)胞30min后，吸去多聚甲醛，用PBS洗3次，每次5min。然后向孔內(nèi)加入含有1% Tritonx-100和1% BSA的PBS室溫放置2h后吸去孔內(nèi)液體，加入Smad2/3和SQSTM1/p62一抗稀釋液(稀釋濃度均為1∶100)4℃濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜。次日先吸去一抗稀釋液，用PBS漂洗3次，每次5min，再滴加Alexa Fluor 594標(biāo)記的驢抗兔IgG抗體(1∶100)和Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗小鼠IgG抗體(1∶100)，在室溫下避光孵育2h后用PBS洗3次，每次5min。將含DAPI(0.4μg/mL)的封片劑滴于載玻片上，取出細(xì)胞爬片，將有細(xì)胞面向著載玻片方向貼于載玻片上。在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察并照相。

1.2.6免疫共沉淀實(shí)驗(yàn) 經(jīng)過(guò)分組處理后的HLE-B3細(xì)胞，在棄去培養(yǎng)液后用PBS清洗3遍，加入1mL PBS，使用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，將含有細(xì)胞的PBS轉(zhuǎn)移至EP管中，在5000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min，棄去上清后加入含蛋白酶抑制劑的IP裂解液1mL，輕輕吹懸后置于4℃裂解1h。在12000r/min下離心30min后取上清液，取20μL用于BCA蛋白定量，取50μL加入2×上樣緩沖液50μL，100℃金屬浴中加熱10min作為Input樣品。在其余細(xì)胞裂解液加入5μL p62抗體，4℃搖床上緩慢搖晃過(guò)夜。在上述混合液中加入protein A/G磁珠20μL，經(jīng)孵育4h后將樣品置于磁力架輕輕顛倒10次，此時(shí)含有IP的分子及其結(jié)合的蛋白的磁珠被吸附在EP管壁上。棄去上清液，再加入IP裂解液輕輕顛倒10次，重復(fù)3遍，棄去上清，在含磁珠的EP管中加入2×上樣緩沖液50μL，充分震蕩混勻后于100℃金屬浴中加熱10min，即為IP樣品。根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度從每個(gè)Input樣品中取30μg蛋白上樣，根據(jù)一次Western blot預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整正式IP時(shí)的上樣量，保證每個(gè)組免疫沉淀物中的SQSTM1/p62的量基本一致。

2 結(jié)果

2.1高糖促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生EMT Western blot結(jié)果顯示，隨著高糖刺激時(shí)間(0～48h)的延長(zhǎng)，HLE-B3細(xì)胞的上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)量逐漸降低(F=67.52，P<0.0001)，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)量逐漸升高(F=53.37，P<0.0001)，而且各時(shí)間點(diǎn)與高糖處理前(0h)相比，E-cadherin和α-SMA表達(dá)量均有顯著性差異(P12h=0.015、0.033；P24h=0.0003、0.0006；均P48h<0.0001；圖1A～C，表1)。同時(shí)，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖處理12、24、48h時(shí)，劃痕面積較NC組明顯縮小，HG組細(xì)胞遷移百分比均比NC組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖1D、E，表2)，提示高糖刺激增強(qiáng)了細(xì)胞的移行能力，這與Western blot結(jié)果相一致。以上結(jié)果提示晶狀體上皮細(xì)胞在高糖培養(yǎng)環(huán)境下發(fā)生了EMT。

2.2高糖抑制HLE-B3細(xì)胞內(nèi)自噬水平 為探究高糖環(huán)境下細(xì)胞自噬水平的變化，我們檢測(cè)了高糖處理HLE-B3細(xì)胞0～48h自噬標(biāo)志蛋白水平的變化。LC3、Beclin 1和SQSTM1/p62是參與自噬過(guò)程的重要蛋白，LC3參與自噬體溶酶體膜的延伸[9]；Beclin 1在自噬的起始階段發(fā)揮重要作用；SQSTM1/p62結(jié)合泛素化蛋白后與LC3形成復(fù)合物，最終在溶酶體內(nèi)降解[10]。Western blot結(jié)果顯示，隨著高糖刺激時(shí)間的增加，細(xì)胞LC3 Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1的表達(dá)量逐漸降低，而且在24h時(shí)達(dá)到最低，48h不再有明顯改變(F=163、206，均P<0.0001，圖2A～C，表3)；而SQSTM1/p62的表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加(F=302.1，P<0.0001，圖2A、D，表3)。

圖1 HLE-B3細(xì)胞在高糖環(huán)境下發(fā)生EMT A：Western blot檢測(cè)高糖刺激HLE-B3細(xì)胞48h后EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin和α-SMA的表達(dá)；B～C：E-cadherin和α-SMA的表達(dá)量化分析(aP<0.05，bP<0.01vs0h；cP<0.05，dP<0.01vs12h；fP<0.01vs24h)；D：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移百分比的量化分析(bP<0.01vsNC組)；E：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×100)。

培養(yǎng)時(shí)間E-cadherinα-SMA0h1.22±0.110.56±0.0712h1.03±0.01a0.73±0.02a24h0.87±0.03a,c0.90±0.03a,c48h0.57±0.02a,c,e1.16±0.09a,c,e F67.5253.37P<0.0001<0.0001

注：aP<0.05vs0h；cP<0.05vs12h；eP<0.05vs24h。

組別0h12h24h48hNC組014.63±3.1327.69±2.5252.75±4.00HG組062.76±3.51b80.84±3.06b90.17±4.51b t-17.7123.2610.75P-<0.0001<0.00010.0004

注：F時(shí)間=698.8，P時(shí)間<0.0001；F組間=72.95，P組間=0.001；F組間×?xí)r間=12.87，P組間×?xí)r間=0.0005。bP<0.01vsNC組。

2.3上調(diào)HLE-B3細(xì)胞的自噬水平可抑制高糖誘導(dǎo)的EMT 為了探討自噬對(duì)HLE-B3細(xì)胞發(fā)生EMT的調(diào)節(jié)作用，我們使用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素(200nmol/L)對(duì)高糖刺激的HLE-B3細(xì)胞處理24h，用Western blot檢測(cè)HLE-B3細(xì)胞自噬和EMT標(biāo)志蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果表明，與NC組相比，HG組HLE-B3細(xì)胞LC3 Ⅱ/Ⅰ及E-cadherin蛋白表達(dá)降低(P=0.0042、0.0001)，而α-SMA蛋白表達(dá)增加(P<0.0001)，這與2.1部分的結(jié)果一致；RAPA組與HG組、DMSO組相比，LC3 Ⅱ/Ⅰ、E-cadherin蛋白表達(dá)水平有所提高(P<0.0001、=0.0087；P<0.0001、=0.0245)，α-SMA蛋白表達(dá)水平有所降低(P=0.0001、<0.0001)，但與NC組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0051、0.0136、<0.0001)，DMSO組與HG組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.9997、0.8625、0.7128)，見(jiàn)圖3A～D，表4，提示雷帕霉素可逆轉(zhuǎn)高糖引起的自噬水平降低及EMT增強(qiáng)的變化。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與NC組相比，HG組和DMSO組細(xì)胞的移行數(shù)量顯著增加(均P<0.0001)，提示高糖促進(jìn)了HLE-B3細(xì)胞的移行，而RAPA組細(xì)胞的移行數(shù)量明顯低于HG組和DMSO組(P=0.0002、0.0004)，但仍高于NC組(P=0.0021)，提示雷帕霉素對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞移行有所抑制，與Western Blot結(jié)果相一致(圖3E、F，表4)。

圖2 HLE-B3細(xì)胞在高糖環(huán)境下自噬水平下降 A：Western blot檢測(cè)高糖刺激HLE-B3細(xì)胞48h自噬標(biāo)志蛋白LC3、Beclin 1、SQSTM1/p62的表達(dá)變化；B～D：LC3、Beclin 1、SQSTM1/p62蛋白表達(dá)的量化分析(bP<0.01vs0h；dP<0.01vs12h；fP<0.01vs24h)。

培養(yǎng)時(shí)間LC3Ⅱ/ⅠBeclin 1SQSTM1/p620h1.65±0.051.13±0.050.24±0.0312h1.17±0.06b0.75±0.02b0.66±0.03b24h0.62±0.07b,d0.49±0.05b,d0.81±0.02b,d48h0.66±0.07b,d0.43±0.03b,d0.99±0.04b,d,fF163206302.1P<0.0001<0.0001<0.0001

注：bP<0.01vs0h；dP<0.01vs12h；fP<0.01vs24h。

2.4上調(diào)HLE-B3的自噬水平可抑制TGF-β信號(hào)通路 既往研究表明，晶狀體上皮細(xì)胞在高糖培養(yǎng)下，細(xì)胞TGF-β信號(hào)通路被激活，表現(xiàn)為分泌型TGF-β和Smad2/3磷酸化蛋白水平升高[3，11-13]。TGF-β信號(hào)通路是細(xì)胞發(fā)生EMT的經(jīng)典通路，自噬可能通過(guò)影響TGF-β信號(hào)通路而影響EMT。因此我們檢測(cè)了雷帕霉素對(duì)高糖刺激的HLE-B3細(xì)胞中TGF-β2、Smad2/3、p-Smad2/3及Snail蛋白水平的影響。Western blot結(jié)果顯示，與NC組相比，高糖刺激(HG組、DMSO組)細(xì)胞中TGF-β2(P=0.0044、0.008)、p-Smad2/Smad2(均P<0.0001)、p-Smad3/Smad3(均P<0.0001)及Snail(均P<0.0001)蛋白水平均有所升高；加入雷帕霉素處理后，相較高糖刺激(HG組、DMSO組)細(xì)胞，TGF-β2表達(dá)無(wú)明顯改變(P=0.8142、0.5504，圖4A、B，表5)，但p-Smad2/Smad2(P=0.0015、0.0001)、p-Smad3/Smad3(P=0.0111、0.0042)以及Snail(P=0.0042、0.0016)的表達(dá)量明顯降低(圖4A、C～E，表5)；但相較NC組，這些指標(biāo)仍有比較明顯的升高(P<0.0001、=0.0018、0.0131，表5)。以上結(jié)果表明上調(diào)細(xì)胞自噬水平可部分抑制高糖激活的由TGF-β2介導(dǎo)的EMT信號(hào)通路。

2.5自噬通過(guò)SQSTM1/p62與Smad2/3相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)EMT的調(diào)節(jié) 為了探究自噬信號(hào)通路與TGF-β信號(hào)通路之間的串?dāng)_，我們觀(guān)察了SQSTM1/p62與Smad2/3之間的直接交互作用。首先，通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色觀(guān)察兩者的胞內(nèi)分布情況，發(fā)現(xiàn)SQSTM1/p62與Smad2/3均位于細(xì)胞質(zhì)，并存在共定位的情況(圖5A)。

對(duì)不同處理的HLE-B3細(xì)胞進(jìn)行了SQSTM1/p62的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，Input部分結(jié)果表明，Smad2/3與SQSTM1/p62在各處理組細(xì)胞中均存在，且Smad2/3和SQSTM1/p62在HG組表達(dá)高于NC組，而RAPA組與HG組、DMSO組相比，SQSTM1/p62表達(dá)有所降低(圖5B，Input)，證實(shí)雷帕霉素可以激活細(xì)胞的自噬，同時(shí)細(xì)胞中存在SQSTM1/p62和Smad2/3蛋白表達(dá)(陽(yáng)性對(duì)照)。在用SQSTM1/p62抗體進(jìn)行免疫共沉淀的蛋白復(fù)合物中，通過(guò)Western blot檢測(cè)到SQSTM1/p62和Smad2/3蛋白，表明SQSTM1/p62與Smad2/3存在相互作用，而且在SQSTM1/p62表達(dá)量基本一致的情況下，與NC組相比，HG組結(jié)合的Smad2/3更少，RAPA組與HG組相比有所增加，提示高糖可能抑制了SQSTM1/p62和Smad2/3的結(jié)合，而雷帕霉素部分逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象(圖5B，IP)。

3 討論

白內(nèi)障是糖尿病患者視力損害的主要原因之一[14]。白內(nèi)障摘除術(shù)仍是目前唯一有效的治療方法[15]。與非糖尿病患者相比，糖尿病患者出現(xiàn)手術(shù)并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)較高，如囊膜收縮和混濁、黃斑水腫和糖尿病視網(wǎng)膜病變加重等[16]。所以，研究藥物防治糖尿病白內(nèi)障很有必要。人們對(duì)糖尿病白內(nèi)障發(fā)病機(jī)理的探索從未停止，陳文靜等[17]發(fā)現(xiàn)高糖可以抑制HLE-B3細(xì)胞葡萄糖關(guān)鍵代謝酶(6-磷酸果糖激酶-1、丙酮酸激酶、己糖激酶、檸檬酸合成酶、α-酮戊二酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶)的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究采用高糖刺激HLE-B3細(xì)胞以模擬糖尿病患者中晶狀體上皮細(xì)胞的生存狀態(tài)，觀(guān)察晶狀體上皮細(xì)胞EMT及自噬水平的改變，并通過(guò)雷帕霉素干預(yù)自噬水平，觀(guān)察對(duì)細(xì)胞發(fā)生EMT的影響，探討自噬對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞EMT的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。

圖3 雷帕霉素增強(qiáng)細(xì)胞自噬并抑制高糖誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞發(fā)生EMT A：Western blot檢測(cè)雷帕霉素對(duì)高糖刺激HLE-B3細(xì)胞自噬和EMT標(biāo)志蛋白LC3、E-cadherin和α-SMA表達(dá)的影響；B～D：LC3、E-cadherin和α-SMA蛋白表達(dá)的量化分析；E：Transwell實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞遷移數(shù)量的量化分析；F：Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×200)。aP<0.05，bP<0.01vsNC；dP<0.01vsHG；eP<0.05，fP<0.01vsDMSO。

組別LC3 Ⅱ/ⅠE-cadherinα-SMA遷移細(xì)胞數(shù)(個(gè))NC組1.61±0.101.16±0.120.45±0.0526.67±3.06HG組1.16±0.10a0.60±0.05a1.16±0.04a79.33±7.37aDMSO組1.17±0.08a0.65±0.04a1.21±0.05a77.00±2.65aRAPA組2.04±0.14a,c,e0.89±0.08a,c,e0.81±0.06a,c,e49.33±4.04a,c,e F45.5231.41157.283.26P<0.0001<0.0001<0.0001<0.0001

注：aP<0.05vsNC組；cP<0.05vsHG組；eP<0.05vsDMSO組。

細(xì)胞發(fā)生EMT的標(biāo)志是失去粘附連接和細(xì)胞極性，獲得間充質(zhì)表型及獲得運(yùn)動(dòng)性和侵襲性[18]，表現(xiàn)在上皮標(biāo)志物E-cadherin、ZO-1的下調(diào)以及間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、α-SMA、Fibronectin、Vimentin等的上調(diào)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已證明高糖可通過(guò)c-Src/TGF-β信號(hào)途徑誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生EMT[4]。Zhang等[2]觀(guān)察到在白內(nèi)障患者中，晶狀體上皮細(xì)胞E-cadherin較正常人表達(dá)減少，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和Vimentin表達(dá)增加，表明EMT是糖尿病白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中的重要事件。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著高糖刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，HLE-B3細(xì)胞內(nèi)E-cadherin表達(dá)量逐漸下調(diào)，而α-SMA表達(dá)量上調(diào)；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)提示HLE-B3細(xì)胞在高糖環(huán)境下獲得了更強(qiáng)的移行能力，證實(shí)高糖刺激晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生了EMT。

自噬是一種進(jìn)化保守的分解代謝過(guò)程，通過(guò)形成雙層膜的自噬體，將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的大分子和細(xì)胞器等傳遞至溶酶體進(jìn)行降解，實(shí)現(xiàn)再利用。根據(jù)底物進(jìn)入溶酶體途徑的不同，可將自噬分為分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy)、微自噬(microautophagy)和巨自噬(macroautophagy)，其中研究的最為透徹是巨自噬。巨自噬受多種信號(hào)途徑的調(diào)控，mTOR是自噬的主要調(diào)控因子，其驅(qū)動(dòng)主要的抑制信號(hào)[19]，既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雷帕霉素—mTORC1的抑制劑，具有促進(jìn)自噬的作用[20]。LC3被稱(chēng)為微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(MAP1LC3)，是公認(rèn)的自噬標(biāo)志物。LC3 Ⅰ被Atg7和Atg3相關(guān)的泛素樣系統(tǒng)修飾和處理，與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3 Ⅱ[21]。通常用LC3 Ⅱ與LC3 Ⅰ的比值表示細(xì)胞自噬水平的高低，比值高代表細(xì)胞內(nèi)自噬水平高。Beclin 1作為自噬復(fù)合體的重要組成部分，在自噬活性發(fā)揮關(guān)鍵作用[22]，其表達(dá)水平與自噬活性呈正相關(guān)。作為重要的選擇性自噬接頭蛋白，SQSTM1/p62在自噬清除泛素化蛋白過(guò)程中作為受體參與其中，其表達(dá)量與自噬水平呈負(fù)相關(guān)[23]。本研究中，高糖處理的HLE-B3細(xì)胞LC3 Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1隨著時(shí)間的推移明顯降低，并在24h后維持在較低水平；而SQSTM1/p62隨著時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)明顯增加。結(jié)果表明，高糖抑制了HLE-B3細(xì)胞的自噬。

糖尿病對(duì)不同細(xì)胞自噬水平的影響似乎不盡相同，但最終對(duì)細(xì)胞EMT可產(chǎn)生類(lèi)似的影響。Zhuang等[24]發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病中腎小管上皮細(xì)胞自噬受到抑制，抑制血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶1(serum and glucocorticoid induced kinase，SGK1)可通過(guò)PI3K/AKT/mTOR通路促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞自噬和抑制EMT，Jin等[25]研究表明HMGB1通過(guò)誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬參與糖尿病腎病的發(fā)展，HMGB1 siRNA聯(lián)合雷帕霉素可通過(guò)抑制AKT/mTOR和TGF-β/Smad信號(hào)通路防止足細(xì)胞凋亡和EMT進(jìn)展。既往有關(guān)晶狀體上皮細(xì)胞的研究表明，在用TGF-β誘導(dǎo)的后囊膜混濁細(xì)胞模型中，使用mTOR抑制劑PP242或者靶向mTOR的siRNA可提高細(xì)胞的自噬水平，進(jìn)而抑制晶狀體上皮細(xì)胞的增殖和遷移[26-27]。本研究結(jié)果顯示，雷帕霉素提高了高糖環(huán)境下細(xì)胞的自噬水平，部分抑制了高糖誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞發(fā)生的EMT。

圖4 雷帕霉素抑制高糖激活的HLE-B3細(xì)胞中TGF-β信號(hào)通路 A：Western blot檢測(cè)雷帕霉素對(duì)高糖刺激HLE-B3細(xì)胞中TGF-β2、Smad2/3、p-Smad2/3、Snail的蛋白表達(dá)的影響；B～E：TGF-β2、Smad2/3、p-Smad2/3、Snail的蛋白表達(dá)的量化分析(aP<0.05，bP<0.01vsNC；cP<0.05，dP<0.01vsHG；fP<0.01vsDMSO)。

圖5 HLE-B3細(xì)胞中SQSTM1/p62與Smad2/3蛋白之間的相互作用 A：細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果，紅色為Smad2/3，綠色為SQSTM1/p62，藍(lán)色為細(xì)胞核，白色箭頭所示為黃色，即Smad2/3與SQSTM1/p62共定位所在(×60)；B：免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Input為陽(yáng)性對(duì)照，Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞均可表達(dá)Smad2/3與SQSTM1/p62蛋白；IP為實(shí)驗(yàn)組，用SQSTM1/p62抗體免疫共沉淀后，經(jīng)Western blot檢測(cè)蛋白復(fù)合物中SQSTM1/p62、Smad2/3的表達(dá)情況。

組別TGF-β2p-Smad2/Smad2p-Smad3/Smad3SnailNC組0.84±0.090.35±0.050.59±0.030.59±0.03HG組1.10±0.04a0.98±0.03a1.00±0.06a1.12±0.10aDMSO組1.07±0.05a1.08±0.06a1.03±0.06a1.15±0.06aRAPA組1.14±0.07a0.77±0.04a,c,e0.82±0.04a,c,e0.81±0.05a,c,e F14.05159.149.8651.93P0.0015<0.0001<0.0001<0.0001

注：aP<0.05vsNC組；cP<0.05vsHG組；eP<0.05vsDMSO組。

為了探究雷帕霉素抑制HLE-B3細(xì)胞發(fā)生EMT的原因，我們檢測(cè)了雷帕霉素對(duì)EMT的經(jīng)典信號(hào)通路—TGF-β信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在高糖刺激的HLE-B3細(xì)胞中TGF-β2、p-Smad2/3以及EMT關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)增加。雷帕霉素處理后，TGF-β2表達(dá)未見(jiàn)明顯改變，而p-Smad2/3以及Snail的表達(dá)受到了抑制。提示提高HLE-B3細(xì)胞的自噬水平可以抑制高糖激活的TGF-β信號(hào)通路，繼而抑制細(xì)胞的EMT。那么自噬信號(hào)通路又是怎樣與TGF-β信號(hào)通路產(chǎn)生串?dāng)_呢？研究結(jié)果表明，SQSTM1/p62與Smad2/3存在相互作用，在高糖環(huán)境中這種相互作用有所減弱，雷帕霉素處理后兩者的結(jié)合增強(qiáng)。我們推測(cè)SQSTM1/p62作為自噬接頭蛋白，與Smad2/3結(jié)合并介導(dǎo)了Smad2/3通過(guò)自噬而降解。高糖環(huán)境下，自噬受到抑制，Smad2/3得以累積，而雷帕霉素提高細(xì)胞自噬水平后，自噬對(duì)Smad2/3的降解增加，可能引起其中p-Smad2/3的量減少，Smad2/3下游分子Snail也受到抑制，從而抑制了高糖誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞發(fā)生的EMT。

綜上所述，晶狀體上皮細(xì)胞HLE-B3在高糖刺激下發(fā)生EMT，同時(shí)自噬受到抑制；利用雷帕霉素提高細(xì)胞的自噬水平可以通過(guò)SQSTM1/p62與Smad2/3的相互作用下調(diào)p-Smad2/3的表達(dá)，從而抑制了TGF-β信號(hào)通路，起到抑制細(xì)胞EMT的作用，表明提高細(xì)胞自噬水平可能對(duì)高糖刺激的晶狀體上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，這為未來(lái)從自噬角度研發(fā)糖尿病白內(nèi)障的防治藥物提供了理論依據(jù)。但本研究還存在一些局限性，目前的結(jié)果提示200nmol/L雷帕霉素可部分逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞EMT，能否通過(guò)改變雷帕霉素的劑量達(dá)到完全逆轉(zhuǎn)EMT的作用還有待進(jìn)一步研究，此外，以上研究結(jié)果還有待在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。