景天三七總酚酸的提取工藝及抗氧化性研究

楊艷俊，楊秀東，王亞紅

(吉林化工學院 化學與制藥工程學院 ，吉林 吉林 132000)

景天三七(SedumaizoomL.)為景天科景天屬多年生草本植物的全草，又名土三七、土人參、馬三七、養(yǎng)心草等，分布廣泛，在我國華北、東北、西北及長江流域山地、林緣、林下、河岸及陰濕草地均有生長[1-2].景天三七味甘、性平、微酸，肝經(jīng)、歸心，有止血、活血化瘀等功效，臨床用于治療吐血、便血、跌打損傷、清熱涼血、安神補血、外傷出血[3]，還用于治療神經(jīng)衰弱、失眠、煩躁不安[4]等癥狀.現(xiàn)代藥理研究表明，其含有生物堿、多種酚酸、谷甾醇、黃酮類[5-6]、齊墩果酸、景天庚糖及多種揮發(fā)油[7]等藥用成分，且無毒副作用，景天三七還具有良好的抗氧化作用[8].景天三七酚酸化合物主要成分為沒食子酸、對羥基苯甲酸、沒食子酸甲酯等[9].酚酸類化合物具有抗炎、抗病毒、抗癌、凝血、抗氧化以及調節(jié)生理活性等作用.景天三七還可以加工成保健食品、藥品、茶飲料[10]等產(chǎn)品.景天三七抗氧化能力較強，陳惠卿的土三七總酚酸抗氧化活性的研究表明在3個不同的抗氧化活性評價模型中，土三七總酚酸呈現(xiàn)了不同的抗氧化活性[11].提取酚酸的方法主要有水浸提法、有機溶劑法、超聲輔助法[12]、堿液提取法、微波輔助提取法[13-14]和超臨界CO2萃取法[15]等.本實驗考察的是超聲輔助法提取景天三七總酚酸.

1 材料與方法

1.1 材料

沒食子酸，HPLC≥98%，DPPH≥98%，ABTS(≥98%)，維生素C(≥99%)均來自上海伊卡生物技術有限公司；無水乙醇、三氯化鐵，濃鹽酸，鐵氰化鉀，十二烷基硫酸鈉，過硫酸鉀均為分析純.

1.2 儀器與設備

RT-08型粉碎機，北京開創(chuàng)同和發(fā)展有限公司；TD6001C型電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；FA2204N型分析天平，上海菁海儀器有限公司；HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司；DHG-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式多用真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；752N型紫外分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；KQ-250DE型超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 對照品及供試品溶液配制

精密稱取5 mg沒食子酸標準品加入到250 mL容量瓶中，加入無水乙醇至刻度線，配成濃度為20 μg/mL的標準品溶液.

精密稱取2 g景天三七粉末于100 mL燒瓶中，加入70%乙醇溶液浸泡1 h，在一定條件下的超聲清洗器中提取，提取液減壓抽濾，定容到50 mL容量瓶中，用1 mL移液管吸取1 mL提取液置于50 mL容量瓶中，定容，為待測溶液.

1.3.2 標準曲線的繪制

通過實驗方法學研究得知，精密度實驗RSD=0.98%，重現(xiàn)性實驗RSD=2.4%，穩(wěn)定性實驗在20～45 min時最穩(wěn)定.

精密吸取6份“1.3.1”項下的已知總酚酸含量的提取液，按“1.3.2”項下方法測定吸光度，總酚酸量記為G1，每份加入總酚酸量記為G2對照品溶液，測定混合液的吸光度值，總酚酸量記為G3，加樣回收率的計算式為(G3- G1)/G2，6份數(shù)據(jù)平均，并計算偏差.

1.3.3 供試品含量測定及提取率計算

精密移取1 mL已配制好的供試品溶液，置于25 mL容量瓶中，按1.3.2方法測吸光度，代入標準曲線計算樣品中總酚酸的提取率.提取率計算公式：

(1)

其中W為總酚酸的提取率，%；c為紫外分光光度計測得的吸光度按照標準曲線計算得到的總酚酸的濃度，mg/mL；V為測吸光度時供試品溶液的體積，mL；m為藥材景天三七的質量，g.

1.3.4 單因素實驗

1.3.4.1料液比對總酚酸提取率的影響

1.3.4.2 溫度對總酚酸提取率的影響

1.3.4.3 提取時間對總酚酸提取率的影響

1.3.4.4 乙醇濃度對總酚酸率的影響

1.3.5 正交實驗

根據(jù)相關文獻及單因素實驗結果來設計正交實驗.考慮乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間4個因素對景天三七總酚酸提取的影響，每個因素設計3個水平，按照L9(34)正交設計表來進行正交實驗，驗證提取的最佳條件，如表1所示.

表1 總酚酸提取率的正交實驗水平設計

1.3.6 抗氧化實驗

1.3.6.1 對DPPH自由基的清除能力

量取不同濃度景天三七提取液加入DPPH溶液[16]，在517 nm處測定吸光度為A樣品.將不同濃度的供試品溶液加入測定吸光度記為A對照.用蒸餾水代替供試品溶液，加入DPPH溶液，在517 nm處測定吸光度記為A空白.用同樣條件測定Vc對DPPH自由基的清除能力.DPPH清除率清除率%=(A空白-A樣品+A對照)/A空白×100%.

1.3.6.2 對ABTS自由基陽離子的清除

將配制的ABTS自由基陽離子溶液[17]在波長734 nm處測量吸光度并記為A空白.不同濃度的供試品溶液測其吸光度值A.用Vc作為對照，將Vc配成不同濃度按照上述方法進行實驗，測得Vc對ABTS自由基陽離子的清除率.ABTS陽離子自由基清除率的清除率%=(A空白-A)/A空白×100%.

2 結果與分析

2.1 加樣回收率實驗結果

加樣回收率的實驗結果如表2所示，平均加樣回收率為99.22%，RSD為1.71%，表明數(shù)據(jù)準確度較好.

表2 回收率結果

2.2 單因素實驗

2.2.1 料液比對總酚酸提取率的影響

不同料液比的總酚酸提取率分別為2.50%、3.30%、3.28%、3.27%、3.29%.

料液比圖1 料液比對總酚酸提取率的影響

2.2.2 溫度對總酚酸提取率的影響

不同提取溫度的總酚酸含量分別為2.55%、2.76%、3.19%、3.10%、2.96%.由圖2可知隨著溫度的升高，總酚酸的提取率逐漸增大.當溫度達到50 ℃時，總酚酸的提取率達到最大，最適宜提取溫度為50 ℃.

溫度/℃圖2 溫度對總酚酸提取率的影響

2.2.3 提取時間對總酚酸提取率的影響

提取時間的總酚酸提取率分別為2.55%、2.89%、3.00%、3.19%、3.10%.

由圖3可知隨著提取時間的增長，總酚酸的提取率逐漸增大.當提取時間達到60 min時，提取率最高，選擇提取時間為60 min最為合適.

時間/min圖3 提取時間對總酚酸提取率的影響

2.2.4 乙醇濃度對總酚酸提取率的影響

不同乙醇濃度的總酚酸提取率分別為2.68%、2.96%、3.27%、3.35%、2.68%.

由圖4可知，隨著乙醇濃度的增大，總酚酸的提取率也不斷提高.當乙醇濃度為70%時，提取率達到最高，應該在此濃度下溶媒的極性與所提取的總酚酸相當，所以提取效果最好，再繼續(xù)提高乙醇濃度時，溶媒極性下降后導致總酚酸的提取率也不斷隨之下降，乙醇濃度選擇為70%時最為合適.

乙醇濃度/%圖4 乙醇濃度對總酚酸提取率的影響

2.3 正交實驗

正交實驗結果如表3所示.由表可知，RT>Rt>RE>Rc，即在景天三七總酚酸的提取工藝中，影響因素最大的是提取溫度，其次為提取時間、提取料液比，乙醇濃度最小.以最小誤差項作為來源項，其中提取時間、提取溫度、提取料液比的影響差異顯著，乙醇濃度對提取影響較小.由于c因素水平離差平方和較小，證明c因素是由于實驗誤差導致因素水平數(shù)值的變化，故將c因素作為誤差項.

表3 總酚酸提取的正交實驗結果與分析

表4 方差來源結果分析

2.4 驗證實驗

2.5 抗氧化實驗

2.5.1 對DPPH自由基的清除能力

景天三七提取液對DPPH自由基清除率分別為：62.73%、68.77%、78.60%、84.56%、90.60%、96.89%，Vc對DPPH自由基清除率分別為：66.48%、80.24%、91.07%、94.62%、96.99%、98.82%.

由圖5可知，景天三七總酚酸提取液對DPPH自由基清除能力隨著濃度的增大而增大，與Vc相比略低，濃度為0.6 mg·mL-1時清除率能達到96.89%.

溶液濃度/(mg·mL-1)圖5 景天三七提取液與Vc溶液對DPPH自由基清除能力對比

2.5.2 對ABTS自由基的清除能力及結果分析

景天三七提取液對ABTS自由基清除率分別為：37.55%、61.17%、64.30%、72.20%、83.07%、97.01%，Vc對ABTS自由基清除率分別為：56.70%、62.39%、65.53%、78.06%、85.74%、97.29%.

由圖6可知，景天三七提取液對ABTS自由基清除率隨著提取液濃度的增加而增大，在濃度為0.6 mg/mL時，對ABTS的清除率達到97.01%，與Vc相接近.

溶液濃度/(mg·mL-1)圖6 景天三七提取液與Vc溶液對ABTS自由基清除能力對比

3 結 論

景天三七提取溶液對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力與Vc的對比可以得出，景天三七提取液與Vc溶液具有相近的體外抗氧化活性.