三七總皂苷結(jié)合針灸干預(yù)對急性缺血性腦卒中大鼠血腦屏障的保護作用及對PI3K/Akt信號通路的影響?

劉 禹 邵海宇 王 琦

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省齊齊哈爾市第一醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾 161005）

腦卒中是由于腦部血管發(fā)生破裂或阻塞，導(dǎo)致血液不能進入大腦相應(yīng)組織，引起腦組織缺血缺氧而導(dǎo)致的一類腦部疾病［1］。腦卒中是全球范圍內(nèi)第二大致死性原因，同時也是引起殘疾的主要原因之一，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率以及高復(fù)發(fā)率的特點，成為一項全球性的公共衛(wèi)生問題［2-3］。目前針對急性缺血性腦卒中臨床治療方式主要包括藥物治療（溶栓藥物、神經(jīng)保護劑）以及手術(shù)治療（機械血栓去除術(shù)），然而由于治療時間窗狹窄、臨床副作用大以及并發(fā)癥風險高等原因，使其在臨床中的應(yīng)用屢遭瓶頸［4］。三七總皂苷（PNS）是五加科植物三七的一種主要有效活性成分，含有多種單體皂苷。藥理學(xué)相關(guān)研究顯示［5-6］，三七總皂苷具有擴張血管、抑制血小板凝集、降低心肌耗氧量、降血脂、清除氧自由基以及抗炎、抗氧化等相關(guān)作用；此外，有學(xué)者研究證實［7］，在急性缺血性腦卒中患者中使用三七總皂苷與阿替普酶溶栓治療，可降低患者溶栓過程中的出血性轉(zhuǎn)化風險，而關(guān)于三七總皂苷對血腦屏障保護作用及其機制目前仍未闡明。針灸治療缺血性腦卒中患者已經(jīng)取得了良好的臨床療效，且學(xué)者認為在腦卒中后偏癱治療中早期針刺治療，可促進肢體功能的康復(fù)，改善患者臨床預(yù)后［8-9］。本研究探討分析PNS結(jié)合針灸治療急性缺血性腦卒中大鼠血腦屏障保護作用及對大鼠PI3K/Akt信號通路的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，實驗動物許可證：SCXK（京）2005-0013。溫度20～25℃，濕度40%～50%，自由飲食、水。

1.2 試藥與儀器

PNS（昆藥集團股份有限公司），使用0.9%氯化鈉注射液配制為質(zhì)量濃度1 mg/mL的溶液備用；伊文思藍（EB）（美國Sigma公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo公司）；maker預(yù)染蛋白（美國Thermo公司）；HRP辣根過氧化物酶標記二抗（北京中杉金橋公司）；兔抗鼠PI3K單克隆抗體（美國Abcam公司）；兔抗鼠Akt單克隆抗體（美國Abcam公司）；ECL發(fā)光試劑盒（美國Pierce公司）；G6805型電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；一次性針灸針（蘇州華佗牌，直徑0.2mm，針身長0.5寸）；多功能酶標儀（美國BioTek公司）。

1.3 造模及分組

將大鼠隨機分為4組，分別是假手術(shù)組、模型組、針灸組、PNS+針灸組，每組各15只。采用Zea Longa線栓法［10］制作大鼠缺血性腦卒中模型，使用4%恩氟烷誘導(dǎo)麻醉，1%～2%恩氟烷混合70%N2O和30%O2維持麻醉，術(shù)中小心分離大鼠右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈以及頸外動脈，使拴線從大鼠頸外動脈殘端插入頸內(nèi)動脈，直至距頸外動脈與頸內(nèi)動脈分叉處1.8 cm處停止。線栓停留1.5 h后拔除栓子，制備缺血/再灌注損傷模型。假手術(shù)組大鼠僅分離上述血管，而不插入栓線。缺血1.5 h后拔除線栓，將大鼠尾部提起，可見大鼠左側(cè)前肢屈曲則視為造模成功。采用差額補充法保證每組實驗大鼠的例數(shù)。

1.4 干預(yù)方法

1）針灸組：造模成功后將不予麻醉的大鼠固定在鼠夾上，根據(jù)華興邦等制定的大鼠針灸穴位進行定位，選取百會、水溝、雙側(cè)內(nèi)關(guān)以及雙側(cè)三陰交。采用捻轉(zhuǎn)、提插補瀉刺激雙側(cè)內(nèi)關(guān)1 mm，強刺激1 min，留針30 min；采用雀啄法有鼻中隔下部向上斜刺水溝1 mm，強刺激1 min；然后再應(yīng)用提插法直刺三陰交5 mm，持續(xù)1 min，留針30 min；最后針刺百會穴，取向后斜刺2 mm，采用平補平瀉捻轉(zhuǎn)法刺激1 min，留針30 min。留針期間，使用G6085電針治療儀連接內(nèi)關(guān)與三陰交穴位針柄，調(diào)整電壓2～4 V，給予疏密波，刺激強度以針刺部位輕微抖動。第1次針刺在造模成功后24 h內(nèi)進行，以后每天固定時間針刺1次，7 d為1個療程。2）PNS+針灸組：術(shù)前10 min給予PNS 10 mg/kg尾靜脈注射，術(shù)后24 h內(nèi)開始針灸治療，治療方法同針灸組，持續(xù)治療14 d，每次針灸治療完成后30 min，給予PNS 10 mg/kg尾靜脈注射。3）假手術(shù)組與模型組：抓取、固定方法同針灸組，但不進行針刺。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 大鼠行為學(xué)評分比較 分別于術(shù)后24 h、術(shù)后3 d、術(shù)后7 d對各組大鼠進行神經(jīng)行為學(xué)評分。0分：大鼠無神經(jīng)缺損癥狀。1分：提起大鼠尾部后，左側(cè)前爪不能完全伸展。2分：爬行時大鼠向左側(cè)轉(zhuǎn)圈。3分：大鼠行走困難且向左側(cè)傾倒。4分：大鼠無法自發(fā)行走且意識喪失。

1.5.2 血腦屏障通透性 各組大鼠完成治療后，每組5只大鼠測定血腦屏障通透性。經(jīng)微靜脈注射EB 4 mL/kg，使其在體內(nèi)循環(huán)2 h后，麻醉，經(jīng)左心室灌注0.9%氯化鈉注射液300 mL，取各組大鼠大腦左右半球進行稱量，加入2 mL甲酰胺勻漿后置于54℃條件下溫育2 h，離心20 min（12 000 g）。采用紫外分光光度計檢測620 nm波長處的吸光度，使用EB標準曲線濃度計算各組大鼠腦組織中EB含量。

1.5.3 腦組織含水量測定 各組大鼠完成治療后，每組5只大鼠測定腦組織含水量，取大鼠大腦左右半球稱質(zhì)量，120℃烤箱烘烤12 h，測量大腦干濕重比，干濕重比=（濕重-干重/濕重）×100%。

1.5.4 Wesren blotting法檢測大鼠腦組織PI3K、Akt蛋白表達 各組大鼠完成治療后，每組使用5只大鼠測定腦組織PI3K、Akt蛋白表達，取大鼠右側(cè)大腦組織用于目的蛋白的表達檢測，用冰0.9%氯化鈉注射液漂洗腦組織清除血液后拭干。取100 mg腦組織，加入細胞裂解液勻漿。離心后取上清，采用BCA蛋白分析法測定蛋白濃度，然后使用懸浮緩沖液調(diào)整蛋白濃度。加入等體積加樣緩沖液后混合均勻，水浴煮沸5 min。取含20 μg蛋白的樣品上樣進行SDS-PAGE電泳分離，然后電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。加入5%脫脂奶粉封閉液37℃封閉1 h，將PVDF膜置于雜交袋內(nèi)，加入適當稀釋后的一抗封閉液，4℃下孵育過夜；PBST漂洗PVDF膜后，常溫二抗孵育1 h，再次漂洗。將ECL液滴于PVDF膜上作用1 min，置于X線片盒中，曝光2～5 min顯影、定影、水洗、晾干。將X線片使用掃描儀掃描，并應(yīng)用Quantity One軟件對各組光密度值進行分析。將目標蛋白光密度值與β-actin光密度值的比值作為目標蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)評分比較

見表1。術(shù)后24 h、術(shù)后3 d、術(shù)后7 d各腦卒中組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），術(shù)后24 h各腦卒中組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分相當（P＞0.05），而術(shù)后3 d、術(shù)后7 d針灸組、PNS+針灸組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分較模型組顯著降低（P＜0.05），且PNS+針灸組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分顯著低于針灸組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠行為學(xué)評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠行為學(xué)評分比較（分，±s）

與假手術(shù)組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與針灸組比較，△P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組針灸組PNS+針灸組n 15 15 15 15術(shù)后24 h 0.00±0.00 3.02±0.35*2.97±0.43*3.08±0.39*術(shù)后3 d 0.00±0.00 2.91±0.24*2.62±0.27*#2.41±0.19*#△術(shù)后7 d 0.00±0.00 2.77±0.41*2.30±0.33*#2.07±0.25*#△

2.2 各組大鼠血腦屏障通透性比較

見表2。各組大鼠左腦組織EB含量相當（P＞0.05），各腦卒中組大鼠右腦組織EB含量顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），其中針灸組與PNS+針灸組大鼠右腦組織EB含量較模型組顯著降低（P＜0.05），而PNS+針灸組大鼠右腦組織EB含量顯著低于針灸組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠腦組織EB含量比較（mg/g，±s）

表2 各組大鼠腦組織EB含量比較（mg/g，±s）

組別假手術(shù)組模型組針灸組PNS+針灸組n 5 5 5 5 EB含量（左腦）8.12±2.03 8.42±1.97 8.31±2.14 8.36±2.08 EB含量（右腦）8.35±2.10 25.63±4.11*19.89±4.52*#16.70±3.96*#△

2.3 各組大鼠腦組織含水量比較

見表3。各組大鼠左腦組織含水量相當（P＞0.05），各腦卒中組大鼠右腦組織含水量顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），其中針灸組與PNS+針灸組大鼠右腦組織含水量較模型組顯著降低（P＜0.05），而PNS+針灸組大鼠右腦組織含水量顯著低于針灸組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腦組織含水量比較（%，±s）

表3 各組大鼠腦組織含水量比較（%，±s）

組別假手術(shù)組模型組針灸組PNS+針灸組n 5 5 5 5含水量（左腦）77.95±0.92 78.12±1.21 78.01±1.68 78.42±1.83含水量（右腦）78.32±1.02 85.64±1.17*#83.08±0.95*#80.22±0.99*#△

2.4 各組大鼠腦組織PI3K、Akt蛋白表達比較

見表4，圖1。各腦卒中組大鼠腦組織PI3K、Akt表達水平均較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.05），其中針灸組以及PNS+針灸組大鼠腦組織PI3K較模型組顯著升高（P＜0.05），且PNS+針灸組大鼠腦組織PI3K表達顯著高于針灸組（P＜0.05）；而模型組、針灸組以及PNS+針灸組大鼠腦組織Akt表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠腦組織PI3K、Akt蛋白相對表達量比較（±s）

表4 各組大鼠腦組織PI3K、Akt蛋白相對表達量比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組針灸組PNS+針灸組n 5 5 5 5 PI3K 0.513±0.042 0.683±0.029*0.819±0.031*#1.281±0.045*#△Akt 1.123±0.061 1.204±0.042*1.191±0.054*1.218±0.048*

圖1 各組大鼠腦組織PI3K、Akt蛋白表達

3 討論

缺血性腦卒中屬于中醫(yī)學(xué)“中風”范疇，其病機多為陰陽失調(diào)、血氣運行受阻、血瘀滯絡(luò)等［11］。針灸治療，包括頭皮針以及電針等治療，由于其具有簡便、經(jīng)濟且療效確切的臨床優(yōu)點，被廣泛用于臨床腦卒中患者康復(fù)過程，本研究采取“醒腦開竅”針刺法進行動物方面研究驗證［12-13］。

關(guān)于PNS治療腦血管病方面神經(jīng)保護機制，目前已經(jīng)有相關(guān)研究報道［14-15］，其中主要集中在PNS抗氧化、抗血管損傷以及抗血小板聚集方面，而關(guān)于PNS對血腦屏障的影響及其機制，尚無相關(guān)報道。此外，藥物聯(lián)合針灸治療缺血性腦卒中一直是臨床關(guān)注的焦點，以更好地提高患者臨床療效、降低患者殘疾率以及病死率，以改善患者臨床預(yù)后［16］。本研究從實驗動物入手，探討分析PNS結(jié)合針灸治療急性缺血性腦卒中大鼠血腦屏障保護作用及對PI3K/Akt信號通路的影響。

本研究結(jié)果顯示，術(shù)后3 d、術(shù)后7 d針灸組以及PNS+針灸組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分較模型組顯著降低，同時PNS+針灸組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分顯著低于針灸組。結(jié)果提示采取針灸、聯(lián)合三七總皂苷治療后，可有效改善大鼠腦卒中后神經(jīng)行為學(xué)，與臨床相關(guān)報道相似［17］。藥物聯(lián)合針灸治療是腦卒中患者早期康復(fù)的重要措施之一，有助于患者治療后肢體功能的恢復(fù)，降低患者致殘率。各腦卒中組大鼠右腦組織EB含量以及腦組織含水量均較假手術(shù)組顯著升高，而針灸組以及PNS+針灸組大鼠右腦組織EB含量以及腦組織含水量較模型組有所降低，其中PNS+針灸組大鼠顯著低于針灸組。血腦屏障是分割血液與大腦的一種復(fù)雜屏障系統(tǒng)，在腦缺血后，可引發(fā)血管內(nèi)皮損傷，細胞外基質(zhì)破壞，從而引起血腦屏障完整性的破壞，導(dǎo)致血腦屏障通透性增加且發(fā)生血源性腦水腫［18］。從本研究來看，缺血性腦卒中模型制作后，可提高大鼠血腦屏障通透性同時增加腦組織含水量，進一步證實腦卒中對血腦屏障的破壞作用。此外，采取針灸治療或聯(lián)合PNS治療均可有效降低大鼠血腦屏障通透性同時降低腦水腫程度，發(fā)揮血腦屏障保護作用，其中PNS聯(lián)合針灸治療對腦卒中大鼠血腦屏障的保護作用更佳。

PI3K/Akt信號通路是腦缺血和神經(jīng)系統(tǒng)凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路之一。研究顯示，大多數(shù)神經(jīng)營養(yǎng)因子均可激活PI3K/Akt信號通路，對神經(jīng)凋亡產(chǎn)生抑制作用，發(fā)揮神經(jīng)保護、減輕血源性腦水腫的發(fā)生［19-20］。國外學(xué)者對大鼠進行缺血預(yù)處理［21］，結(jié)果顯示，缺血預(yù)處理可延長腦缺血發(fā)生后PI3K/Akt信號活化持續(xù)時間，從而在腦缺血耐受中發(fā)揮著重要作用。本研究中，各腦卒中大鼠PI3K、Akt蛋白表達量均較假手術(shù)組顯著升高，針灸組、PNS+針灸組大鼠PI3K蛋白表達量較模型組明顯升高，其中PNS+針灸組大鼠升高程度更為明顯；而針灸組、PNS+針灸組大鼠與模型組比較，Akt蛋白表達量無明顯變化。提示腦卒中發(fā)生后，可導(dǎo)致腦組織PI3K/Akt信號通路的激活，這可能是機體神經(jīng)保護代償性作用之一，而有效的治療可進一步促進該通路的激活程度，以進一步發(fā)揮神經(jīng)保護作用。而關(guān)于治療后Akt蛋白表達與模型組無差異，可能由于實驗樣本量較小或腦卒中后檢驗時間較長等因素有關(guān)。

綜上所述，PNS聯(lián)合針灸治療急性缺血性腦卒中大鼠具有顯著的血腦屏障保護作用，可有效改善大鼠神經(jīng)行為學(xué)狀況，其作用機制可能與促進PI3K/Akt信號通路的激活有關(guān)。