hUC-MSCs移植聯(lián)合腎腦復(fù)元湯干預(yù)對MCAO大鼠及HGF表達(dá)的影響?

鄒 婷 胡國恒 劉 侃 王瑾茜 王小菊

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

缺血性中風(fēng)（CIS），又稱缺血性腦卒中、腦梗死，屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，是指各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性病變壞死，進(jìn)而產(chǎn)生神經(jīng)功能缺損，出現(xiàn)相應(yīng)的臨床表現(xiàn)［1］。中風(fēng)具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點［2］。溶栓有嚴(yán)格治療時間窗的限制、諸多禁忌證，且有易引起顱內(nèi)出血的風(fēng)險［3］，而對癥、保守治療效果欠佳。大量研究證實了間充質(zhì)干細(xì)胞能用來進(jìn)行移植治療腦損傷，有一定療效且安全［4］；前期研究表明［5-6］腎腦復(fù)元湯治療缺血性中風(fēng)不僅能降低卒中后致殘率、死亡率，促進(jìn)神經(jīng)功能的修復(fù)，并對運動、感覺及語言等多項神經(jīng)功能損傷的恢復(fù)有明顯的修復(fù)作用。本研究擬制備局灶性腦缺血（MCAO）大鼠模型，觀察腎腦復(fù)元湯和hUC-MSCs移植對模型大鼠缺血側(cè)腦組織肝細(xì)胞生長因子（HGF）蛋白表達(dá)水平的影響，為缺血性腦卒中的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（300±10）g，均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)［許可證號SYXK（湘）2009-0001］，購于湖南省斯萊克景達(dá)動物實驗有限公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號SYXK（湘）2011-0003］。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境保持清潔、通風(fēng)、恒溫，定期更換墊料，消毒籠具，常規(guī)條件飼養(yǎng)，1周后造模。

1.2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

正常健康順產(chǎn)嬰兒臍帶組織，來自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，已與產(chǎn)婦簽署知情同意書，實驗已獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。組織塊法培養(yǎng)hUC-MSCs；流式細(xì)胞儀對其鑒定［9］，按照間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)（國際細(xì)胞療法協(xié)會），要求CD73、CD105、CD90、CD29陽性表達(dá)率超過95%，CD45、CD34、CD14、CD79a/CD19和HLA-DR的表達(dá)率低于2%；臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活率超過85%。參照Li等［10-11］的方法，將培養(yǎng)細(xì)胞鑒定具備分化成脂、成骨的能力。

1.3 試藥與儀器

腎腦復(fù)元湯：熟地黃10 g，山藥15 g，山茱萸肉10 g，黃芪30 g，牡丹皮10 g，紅景天20 g，當(dāng)歸尾10 g，地龍10 g，赤芍10 g。藥材經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科鑒定為道地藥材，水煎濃縮至含生藥2 g/mL，放置冰箱（4℃）冷藏備用。HGF抗體來自武漢BOSTER公司。主要試劑：兔抗大鼠HGF試劑盒（武漢博士德生物公司）；通用pv9000試劑盒（上海瑞齊生物科技有限公司）；水合氯醛（武漢市法迪斯公司）。主要儀器：精密電子天平（OHAUS），石蠟切片機(jī)（Reicher-thisto STAT），光學(xué)顯微鏡（Olympus），電子體溫計。

1.4 分組與造模

大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組、中藥組、干細(xì)胞組、聯(lián)合組，假手術(shù)組只分離血管不插入線栓，其余各組均予右側(cè)MCAO造模。造模前禁食24 h，術(shù)前稱質(zhì)量，腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.350 g/kg）麻醉并保溫，建立大鼠大腦中動脈內(nèi)栓線阻斷方法［7］，必要時適當(dāng)改進(jìn)。缺血時間達(dá)到2 h后，拔除線栓即形成再灌注。再灌注2 h后按照Zea Longa法［8］的方法，1～3分納入標(biāo)本。

1.5 給藥方法

各組于造模后24 h開始給藥，聯(lián)合組和干細(xì)胞組大鼠局灶性腦缺血2 h再灌注1 d后，經(jīng)尾靜脈注入1×106hUC-MSCs，模型組經(jīng)尾靜脈注入等體積蒸餾水。模型組及干細(xì)胞組分別灌胃等體積蒸餾水（10 mL/kg），聯(lián)合組灌胃等體積腎腦復(fù)元湯。灌胃每日1次，直至處死。各組按處死時間點再隨機(jī)分為給藥后3、7、14 d 3個亞組，每個亞組保證有5只完成實驗。

1.6 標(biāo)本采集與檢測

1.6.1 神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度評分量表（m-NSS）評分 各組分別在造模成功后3、14 d處死前1 h采用改良大鼠m-NSS［10］，對大鼠各項生理功能（運動、感覺功能、平衡能力及生理反射）進(jìn)行等級評分，正常記0分，異常者根據(jù)量表及嚴(yán)重程度記1～6分，總分為18分，無法完成以上某項測驗則計1分。1～6分為輕度損傷，7～12分為中度損傷，13～18分為重度損傷。

1.6.2 腦組織HE染色 采用大鼠腹腔深麻醉（10%水合氯醛0.4 mL/100 g）的方式，將4%多聚甲醛緩沖液約300～400 mL灌注上肢及頭腦，剔除顱骨取腦后，將腦冠狀切開（視交叉平面前后2 mm），留取中間部分置入4%多聚甲醛內(nèi)4℃下固定6 h，然后常規(guī)進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明后石蠟包埋，保存?zhèn)溆?。蠟塊連續(xù)切片，厚5 μm，每隔5片取1張備用。

1.6.3 HGF檢測 采用Western blotting檢測腦組織中HGF蛋白的表達(dá)情況，以GAPDH為內(nèi)參，采用IPP6.0軟件對條帶進(jìn)行圖像分析，以HGF產(chǎn)物與GAPDH產(chǎn)物條帶灰度值的比值（即相對灰度值）作為HGF蛋白表達(dá)的指標(biāo)，相對灰度值越高，說明HGF蛋白表達(dá)程度越高。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能缺損評分比較

見表1。假手術(shù)組未見明顯神經(jīng)功能缺損癥狀。3 d后中藥組與干細(xì)胞組、聯(lián)合組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；7 d后模型組與中藥組、干細(xì)胞組、聯(lián)合組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），聯(lián)合組與中藥組、干細(xì)胞組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）；14 d后模型組與中藥組、干細(xì)胞組、聯(lián)合組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），聯(lián)合組與中藥組、干細(xì)胞組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。隨著用藥時間延長神經(jīng)功能評分逐漸減少，說明腎腦復(fù)元湯及hUC-MSCs移植對大鼠缺血性腦損傷均有一定的保護(hù)作用，具有促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的功能。

表1 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能缺損評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能缺損評分比較（分，±s）

與模型組同時間比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與聯(lián)合組同時間比較，○P＜0.05，○○P＜0.01；與干細(xì)胞組同時間比較，◆P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組中藥組干細(xì)胞組聯(lián)合組n 5 5 5 5 5術(shù)后1 d 0.00±0.00**11.2±0.86 11.40±1.03 11.80±1.07 11.20±0.58術(shù)后3 d 0.00±0.00**9.40±0.75 9.00±0.71◆○7.20±0.66*6.80±0.58**術(shù)后7 d 0.00±0.00**8.00±0.71**5.80±0.66**○○5.60±0.51**○3.60±0.51**術(shù)后14 d 0.00±0.00**5.60±0.68 3.40±0.51**○3.80±0.37**○○1.80±0.37**

2.2 各組梗死區(qū)神經(jīng)細(xì)胞觀察

見圖1。腦組織切片行HE染色后，高倍鏡下（200倍）神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)呈桃紅色，細(xì)胞核為藍(lán)紫色。假手術(shù)組各時間點大鼠CA1區(qū)及DG區(qū)見神經(jīng)細(xì)胞大小、形態(tài)正常，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核大而圓，且居中，核仁清晰無異常表現(xiàn)。聯(lián)合組3個時間點CA1區(qū)和DG區(qū)神經(jīng)元與假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)、排列等相似，且隨著用藥時間的延長與假手術(shù)組的神經(jīng)元相似度越接近，僅見少量神經(jīng)細(xì)胞核變性。

圖1 聯(lián)合組不同時間點腦梗死區(qū)神經(jīng)細(xì)胞（HE染色，200倍）

2.3 各組腦組織HGF表達(dá)比較

見圖2，表2。MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織HGF的表達(dá)在假手術(shù)組均無明顯變化，而在其余各組3、7、14 d HGF的表達(dá)均有不同程度增高，但聯(lián)合組表達(dá)最為明顯；術(shù)后3 d，與模型組比較，中藥組無明顯變化（P＞0.05），干細(xì)胞組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但聯(lián)合組較各組均高（P＜0.01）；術(shù)后7、14 d，中藥組、干細(xì)胞組、聯(lián)合組HGF表達(dá)均增高，說明腎腦復(fù)原湯及hUCMSCs均可促進(jìn)HGF蛋白的表達(dá)，但中藥組與干細(xì)胞組無明顯差異（P＞0.05），聯(lián)合組較中藥組、干細(xì)胞組HGF表達(dá)均增高（P＜0.01），說明二者聯(lián)合效果更佳。

表2 各組大鼠不同時間點缺血側(cè)腦組織內(nèi)HGF表達(dá)比較（相對灰度值，±s）

表2 各組大鼠不同時間點缺血側(cè)腦組織內(nèi)HGF表達(dá)比較（相對灰度值，±s）

組別假手術(shù)組模型組中藥組干細(xì)胞組聯(lián)合組n5 5 5 5 5 3 d 0.076±0.23*0.093±0.01 0.094±0.12○○0.096±0.03*○○0.212±0.52**7 d 0.076±0.12*0.180±0.31 0.185±0.43*○○0.186±0.80*○○0.386±0.15*14 d 0.079±0.13 0.328±0.51 0.550±0.05*○○0.538±0.84*○○0.779±0.26*

圖2 各組腦組織中HGF蛋白的表達(dá)

3 討論

HGF最初是于20世紀(jì)80年代由肝切除的大鼠血漿中分離提純獲得，并對肝損傷后再生起重要作用［12］。原位雜交、免疫組化等研究表明，HGF不僅在神經(jīng)元細(xì)胞中有表達(dá)，且在非神經(jīng)元細(xì)胞，如室管膜、脈絡(luò)叢和松果體等處也有較高水平的表達(dá)。近年研究發(fā)現(xiàn)HGF具有多種生物學(xué)特性，通過與c-met受體結(jié)合，不僅可促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、遷移運動和形態(tài)發(fā)生，而且還在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和形態(tài)維持中具有重要作用；另外，HGF還可通過與其受體結(jié)合直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞而起到生血管作用。研究表明在缺血損傷的組織中，HGF分泌增多、受體上調(diào)，可促進(jìn)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)及增生，并促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的形成。HGF對血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生作用，血管密度的增加可明顯減輕血腦屏障的破壞，保護(hù)血腦屏障的完整性［13］，而不加重腦水腫［14］。HGF是嗜鉻細(xì)胞瘤P12細(xì)胞、鼠胚胎運動神經(jīng)元和胎鼠海馬神經(jīng)元的存活因子，能增強皮質(zhì)軸突的生長和促進(jìn)、腦多巴胺能神經(jīng)元的存活［15］。它還可通過自分泌、旁分泌以及經(jīng)典的軸突逆向轉(zhuǎn)運方式，與特異性c-Met受體結(jié)合而起作用，其具體的作用機(jī)制尚不清楚，可能與cAMP介導(dǎo)的途徑有關(guān)。研究表明，大多數(shù)HGF陽性細(xì)胞能分泌多種營養(yǎng)因子的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，因此HGF作為神經(jīng)營養(yǎng)因子可能在腦缺血后的修復(fù)和重塑中起重要作用［16-17］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腦髓是由腎精化生而成，腎精是腦髓形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。缺血性中風(fēng)好發(fā)于中老年人，蓋因中年之后腎精虧損，髓?？仗摚X絡(luò)失養(yǎng)，遂致腦絡(luò)血液凝澀不暢，發(fā)為中風(fēng)。腎為一身之根本，髓海有病，其本在腎，所以治腎亦即治腦。故腎虛血瘀是缺血性中風(fēng)發(fā)病的重要的病理機(jī)制之一。腎腦復(fù)元湯是根據(jù)從腎治腦、腎腦同治理論遣藥組方而成，方中大量補益藥與活血藥相配，使氣旺血行，活血不傷正，共奏補氣活血通絡(luò)之功，如此則精盛、髓滿、腦充、瘀散、絡(luò)暢、竅通，是經(jīng)臨床驗證對治療缺血性中風(fēng)有良好療效的方藥，該方可明顯改善腦卒中患者的神經(jīng)功能，提高臨床療效，降低致殘率，提高生活質(zhì)量。

本實驗研究顯示，腎腦復(fù)元湯、hUC-MSCs均能促進(jìn)缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)、促進(jìn)HGF的表達(dá)，減輕缺血腦損傷，恢復(fù)神經(jīng)功能，腎腦復(fù)元湯主要在恢復(fù)期發(fā)揮其恢復(fù)神經(jīng)功能的作用，hUC-MSCs在各期均可發(fā)揮作用，二者聯(lián)合效果更佳。

此外，本實驗中，腎腦復(fù)元湯聯(lián)合HUC-MSCs移植治療未見明顯的不良反應(yīng)，HE染色觀察各組腦組織未產(chǎn)生明顯腫瘤細(xì)胞及異形細(xì)胞的增生。因此本實驗也從另一方面驗證了腎腦復(fù)元湯聯(lián)合HUC-MSCs移植治療腦缺血再灌注損傷的安全性，而中藥聯(lián)合干細(xì)胞移植治療腦缺血性損傷的遠(yuǎn)期療效及致瘤性尚需進(jìn)一步研究。