補(bǔ)腎活血湯改善膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠行為學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究?

湯小康 楊 華 劉慧英 周長征 盧 敏 唐成劍

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

骨性關(guān)節(jié)炎（OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變和丟失為主要病理特征的疾病，是中老年人群中的常見病、多發(fā)?。?］。中醫(yī)理論認(rèn)為，OA屬“骨痹”范疇，多因機(jī)體“肝腎虧虛，風(fēng)寒濕邪雜至”，致使人體“氣滯血瘀、經(jīng)絡(luò)痹阻”，為“本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜”之證［2］。補(bǔ)腎活血湯方藥出自《傷科補(bǔ)要》，長于補(bǔ)氣血、強(qiáng)筋骨，其在OA的治療上有著較普遍的運(yùn)用［3］。本實(shí)驗(yàn)用補(bǔ)腎活血湯對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）大鼠進(jìn)行治療干預(yù)，并收集分析相關(guān)行為學(xué)數(shù)據(jù)，為評(píng)估補(bǔ)腎活血湯治療KOA療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)6周齡SD雄性大鼠18只，體質(zhì)量（150±20）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。實(shí)驗(yàn)前在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，每籠3只，空氣相對(duì)濕度維持在30%～40%，室溫維持在21～23℃，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及飲用水飼養(yǎng)。觀察7 d，所有動(dòng)物無疾病及異常后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

補(bǔ)腎活血湯：熟地黃、破故紙、菟絲子各15 g，杜仲、枸杞子、歸尾、山茱萸肉、肉蓯蓉、沒藥、獨(dú)活各9 g，紅花6 g。水煎，每劑200 mL，生藥含量約為0.57 g/mL，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥制劑室提供。

1.3 分組與造模

將SD大鼠隨機(jī)分為補(bǔ)腎活血湯組、模型組及空白組，每組6只，每只大鼠常規(guī)稱體質(zhì)量并記錄。補(bǔ)腎活血湯組和模型組大鼠常規(guī)碘伏與酒精交替消毒腹部和雙膝關(guān)節(jié)，無菌條件下10%水合氯醛腹腔給藥麻醉，雙膝關(guān)節(jié)腔注射4%的木瓜蛋白酶0.2 mL，隔日注射1次，連續(xù)注射2周。空白組大鼠僅常規(guī)碘伏與酒精交替消毒腹部，無菌條件下水合氯醛腹腔給藥麻醉，隔日注射1次，連續(xù)注射2周。補(bǔ)腎活血湯組、模型組及空白組大鼠均置于相同飼養(yǎng)環(huán)境的標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)。

1.4 給藥方法

造模成功后，按人-鼠換算出服藥量為10.31 mg/（kg·d），補(bǔ)腎活血湯組灌胃補(bǔ)腎活血湯，每天2次。模型組和空白組灌胃蒸餾水。連續(xù)給藥4周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 一般情況 連續(xù)2周造模給藥結(jié)束后，觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、體質(zhì)量、膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度等。

1.5.2 小動(dòng)物活體雙膝關(guān)節(jié)活體成像 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，運(yùn)用X線片收集各組大鼠雙膝關(guān)節(jié)影像學(xué)圖像，觀察雙膝關(guān)節(jié)面間隙狹窄、關(guān)節(jié)面磨損及變形、骨贅生成等情況。

1.5.3 自主活動(dòng)次數(shù)測(cè)定 采用大鼠自主活動(dòng)程序測(cè)定儀觀察各組大鼠的自發(fā)活動(dòng)次數(shù)。設(shè)定測(cè)定程序后，將大鼠置入測(cè)定箱中，適應(yīng)3 min后，計(jì)算機(jī)記錄每只大鼠3 min和5 min內(nèi)活動(dòng)次數(shù)以評(píng)估其活動(dòng)度。

1.5.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 給藥結(jié)束后，于上午8∶00～12∶00時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每只大鼠測(cè)定1次，每次10 min。握住SD大鼠尾部1/3處，將其輕輕置入曠場(chǎng)箱中心區(qū)域內(nèi)，開啟計(jì)時(shí)、錄像，記錄各組SD大鼠的平均速度和運(yùn)動(dòng)總長度以評(píng)估其活動(dòng)度。

1.5.5 水迷宮實(shí)驗(yàn) 在同一水迷宮實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，連續(xù)訓(xùn)練4 d，每天訓(xùn)練1次，若大鼠2 min內(nèi)未找到高出水面2 cm站臺(tái)，則將其抓放至站臺(tái)上停留20 s。連續(xù)訓(xùn)練4 d后進(jìn)行正式測(cè)試，記錄各組大鼠找到平臺(tái)時(shí)間和活動(dòng)距離以評(píng)估其活動(dòng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較

見表1。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，造模前補(bǔ)腎活血湯組、模型組和空白組大鼠精神狀態(tài)一致，無明顯萎靡、反應(yīng)遲鈍，雙膝關(guān)節(jié)無明顯腫脹、活動(dòng)不利，各組體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模后2周，補(bǔ)腎活血湯組、模型組大鼠較空白組精神萎靡、反應(yīng)遲鈍，雙膝關(guān)節(jié)可見腫脹、活動(dòng)不利；各組體質(zhì)量比較，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

與空白組造模后比較，?P＜0.05

補(bǔ)腎活血湯組模型組空白組6 6 6 194.00±8.60 195.33±10.23 194.50±8.47 206.83±8.37*202.50±13.37*245.33±7.63

2.2 各組大鼠造模后雙膝關(guān)節(jié)活體成像比較

造模2周后，各組大鼠雙膝關(guān)節(jié)影像學(xué)圖像顯示：補(bǔ)腎活血湯組和模型組大鼠雙膝關(guān)節(jié)面間隙狹窄、關(guān)節(jié)面磨損、變形及骨贅生成較空白組大鼠雙膝明顯。見圖1～圖3。

2.3 各組大鼠自主活動(dòng)次數(shù)比較

見表2。補(bǔ)腎活血湯組、空白組大鼠3 min、5 min內(nèi)自主活動(dòng)次數(shù)均多于模型組大鼠（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

見表3。補(bǔ)腎活血湯組、空白組大鼠10 min活動(dòng)總距離大于模型組大鼠（P＜0.05）。補(bǔ)腎活血湯組、空白組大鼠10 min活動(dòng)平均速度大于模型組大鼠（P＜0.05）。

圖1 補(bǔ)腎活血湯組雙膝關(guān)節(jié)X線片

圖2 模型組雙膝關(guān)節(jié)X線片

圖3 空白組雙膝關(guān)節(jié)X線片

表2 各組大鼠自主活動(dòng)次數(shù)比較（次，±s）

表2 各組大鼠自主活動(dòng)次數(shù)比較（次，±s）

與模型組比較，△P＜0.05。下同

組別補(bǔ)腎活血湯組模型組空白組n 6 6 6 3 min內(nèi)65.50±10.56△41.17±6.11 67.67±4.97△5 min內(nèi)109.00±8.25△62.50±9.42 118.33±5.72△

表3 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

表3 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

組別補(bǔ)腎活血湯組模型組空白組n 6 6 6活動(dòng)總距離（cm）13 396.50±699.32△10 572.67±683.68 16 436.83±716.62△平均速度（cm/s）22.32±1.76△17.62±1.14 27.39±1.19△

2.5 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

見表4。補(bǔ)腎活血湯組、空白組大鼠找到平臺(tái)時(shí)間和活動(dòng)距離均短于模型組大鼠（P＜0.05）。

表4 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

表4 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

組別補(bǔ)腎活血湯組模型組空白組n 6 6 6找到平臺(tái)時(shí)間（s）30.17±6.27△46.83±5.98 19.00±2.37△活動(dòng)距離（cm）1 330.17±128.99△1 741.83±116.95 1 076.33±106.99△

3 討論

OA發(fā)病往往導(dǎo)致患者生活質(zhì)量不同程度的下降，膝關(guān)節(jié)是OA發(fā)病的常見部位［4］。隨著我國人口老齡化程度逐漸上升，KOA已嚴(yán)重影響人民的健康［5］。因KOA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，理想的KOA動(dòng)物模型是研究其發(fā)病機(jī)制、危險(xiǎn)因素及治療方法等的重要手段。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)腔給藥誘發(fā)KOA方法，具有操作簡單、創(chuàng)傷小、成功率高及更接近人KOA病理過程等特點(diǎn)，可用于觀察KOA早期病理改變及研究藥物對(duì)骨關(guān)節(jié)病變的影響［6-7］。本研究采用4%的木瓜蛋白酶大鼠雙膝關(guān)節(jié)腔注射，隔日注射1次，連續(xù)注射2周。造模后較空白組大鼠精神萎靡、反應(yīng)遲鈍，雙膝關(guān)節(jié)可見腫脹、活動(dòng)不利，體質(zhì)量顯著低于空白組大鼠，X線片影像學(xué)顯示造模大鼠雙膝關(guān)節(jié)面間隙狹窄、關(guān)節(jié)面磨損變形及骨贅生成較空白組大鼠明顯。結(jié)果說明木瓜蛋白酶膝關(guān)節(jié)腔注射法能為KOA發(fā)病機(jī)理及干預(yù)措施研究提供良好動(dòng)物模型［8-9］。

補(bǔ)腎活血湯中君藥為熟地黃和山茱萸肉，具有補(bǔ)益肝腎、氣血的功效；臣藥為破故紙、菟絲子、杜仲、枸杞子和肉蓯蓉，有強(qiáng)筋壯骨的功效；歸尾、沒藥、紅花為佐藥，可起到活血通絡(luò)的功效；引藥為獨(dú)活［10］。諸藥配伍，共奏補(bǔ)腎活血之效，使肝腎精氣充足，氣通血暢，以達(dá)行氣、活血、化瘀之功，腎虛血瘀從源頭解決，諸證得除［11］，在退行性O(shè)A的治療中取得了不錯(cuò)的療效［12-13］?，F(xiàn)有研究表明，補(bǔ)腎活血湯具有抑滑膜細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-1β和基質(zhì)金屬蛋白酶-1的功效［14］，補(bǔ)腎活血湯含藥血清能有效促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化［15-16］。自主活動(dòng)次數(shù)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)是評(píng)估大鼠行為學(xué)的重要實(shí)驗(yàn)方法，KOA患者往往表現(xiàn)出主動(dòng)性活動(dòng)減少、生活被動(dòng)等癥狀。在本實(shí)驗(yàn)中與模型組大鼠自主活動(dòng)次數(shù)減少、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)10 min活動(dòng)總距離和平均速度降低及水迷宮實(shí)驗(yàn)找到平臺(tái)時(shí)間和活動(dòng)距離延長等行為學(xué)表現(xiàn)相似，補(bǔ)腎活血湯組大鼠各項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)均優(yōu)于模型組，說明補(bǔ)腎活血湯具有改善膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠行為學(xué)指標(biāo)，治療KOA的功效。