女貞子提取物干預大鼠膝骨關節(jié)炎的實驗研究?

陳春雯 嚴 波 單樂天 王春雷 周 莉△

（1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053；2.浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院，浙江杭州 310000；3.浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 310022）

骨關節(jié)炎（OA）是臨床常見的關節(jié)疾病，有15%～40%的60歲及以上人群受其影響［1-2］。隨著人口老齡化的加劇和肥胖率的上升，OA的患病率逐年增加［3］。女貞子是木樨科植物女貞子的干燥成熟果實，最初記錄于《神農本草經》，主要用于治療骨質疏松癥、關節(jié)炎和骨痛等年齡相關的疾?。?-5］。在中醫(yī)學中，女貞子被認為是具有補腎活血的可食用草本植物，可有效治療腰膝酸軟［6］。根據中醫(yī)的理論和臨床經驗，腎虛與骨關節(jié)疾病發(fā)病有關，補腎活血可促進骨代謝和形態(tài)的發(fā)生［7］。許多補腎活血的中藥已經臨床用于治療OA，取得了積極的效果［8-9］。有研究表明，滋陰補腎法代表方二至丸（由女貞子和墨旱蓮2味中藥組成）通過調節(jié)雌二醇（E2）和C反應蛋白（CRP）的表達，能改善軟骨細胞功能，減輕滑膜炎癥，從而改善絕經后膝骨關節(jié)炎（KOA）的癥狀，將可能開辟治療KOA的有效新途徑［10］。本研究通過動物實驗觀察女貞子提取物對KOA病變中疼痛和軟骨損傷的影響，初步對其作用機制進行探究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠32只，體質量180～220 g，上海斯萊克實驗動物有限公司提供，浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（浙）2013-0016。

1.2 藥物及試劑

女貞子（浙江天道醫(yī)藥有限公司，批號17072201），稱取女貞子粉末100 g置于1 000 mL的圓底燒瓶中，加入10倍量的純水浸泡30 min，加熱回流提取60 min，濾過收集煎液，向殘渣加入8倍量的純水，再加熱回流提取60 min，濾過，合并2次煎液，真空減壓濃縮至1 g/mL，即得女貞子水提液，水提液以5 000 r/min離心10 min，取上清液冷凍干燥成粉末備用。戊巴比妥鈉粉劑（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司）。0.9%氯化鈉注射液（中國大冢制藥有限公司，批號5G70J3）、番紅O染色液（美國Sigma公司）、4%多聚甲醛溶液（中國Solarbio公司）、乙二胺四乙酸（EDTA）（中國Solarbio公司）、碘乙酸鹽（MIA）（美國Sigma公司）、Ⅱ型膠原酶（美國Worthington）、IMDM培養(yǎng)液（美國Gibco公司）、0.25%EDTA-胰蛋白酶（美國Gibco公司）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）粉末（Sigma公司，美國）、二甲亞砜（DMSO）溶液（美國Sigma公司）、胎牛血清（FBS）（美國Gibco BRL，Grand Island，NY）、PBS（美國Phosphate Buffered Saline，Gibco公司）、檸檬酸鈉緩沖液（中國北京市中衫金橋生物技術有限公司）、中性樹膠封片劑（中國北京博奧森生物技術有限公司）、Triton X-100（美國Sigma-Aldrich公司）、SYBR熒光定量試劑盒（中國Takara公司）、反轉錄試劑盒（中國Takara公司）、山羊血清（中國Solarbio公司）、4%多聚甲醛（中國Solarbio公司）、引物（中國上海市生工生物工程股份有限公司）、抗體（美國Danvers，MA）。

1.3 實驗儀器

倒置YLS-3E電子壓痛測定儀（中國安合盟天津科技發(fā)展有限公司）、DK-S12型恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）、SW-CJ-1F層流超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）、AXiovert200熒光倒置顯微鏡（BX20）（日本Olympus公司）、全自動多功能酶標儀（美國BioTek公司）、二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（3111）（美國Thermo公司）。

1.4 分組與造模

32只SD大鼠稱體質量后隨機分組、編號，分為正常組、模型組、女貞子灌胃組、女貞子注射組，每組8只。大鼠膝骨關節(jié)炎疼痛模型采用碘乙酸關節(jié)腔注射造模法。對正常組大鼠雙側后肢膝關節(jié)腔內各注射50 μL 0.9%氯化注射液，其他組大鼠均通過向雙側后肢膝關節(jié)腔內注射50 μL MIA（30 mg/mL），建立大鼠KOA疼痛模型［11］。

1.5 干預方法

造模成功后，女貞子灌胃組采用女貞子提取物3.5 g/kg［10］灌胃處理，女貞子注射組采用關節(jié)腔內注射給藥方式，向大鼠膝關節(jié)腔注射50 μL女貞子提取物（100 μg/mL），正常組和模型組大鼠雙側后肢膝關節(jié)腔內各注射50 μL 0.9%氯化注射液。治療持續(xù)4周，于末次給藥后1周測定行為學數(shù)據。治療結束后，大鼠麻醉處死，進行膝關節(jié)取樣。

1.6 大鼠軟骨細胞提取

采用膠原酶和胰蛋白酶連續(xù)消化法分離3周齡SD大鼠（n=4）膝關節(jié)軟骨細胞。將收集的軟骨片切成1 mm3小塊，用0.25%胰蛋白酶在37℃水浴鍋內消化40 min，0.2%Ⅱ型膠原酶消化4 h。收集的細胞液用細胞篩（70 μm）過濾，離心棄上清。培養(yǎng)基（IMDM內添加10%胎牛血清和1%抗生素）重懸軟骨細胞，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2日更換1次培養(yǎng)基。當軟骨細胞達到80%融合后傳代，備用。

1.7 指標測定

1.7.1 壓痛測定 應用YLS-3E電子壓痛儀測定大鼠的痛閾。將大鼠裝入固定桶內，使其處于舒適又固定的狀態(tài)，用扁形頭對大鼠雙側后足背施壓，當大鼠因疼痛出現(xiàn)鳴叫或掙扎時顯示的壓力值即為此大鼠的痛閾值。實驗開始前測定基礎痛閾，于造模后的第4周測定痛閾。

1.7.2 組織病理學分析 造模給藥4周后，將大鼠麻醉處死，切取所有大鼠的膝關節(jié)，標記后在4%多聚甲醛中固定72 h，用10%EDTA脫鈣液處理。連續(xù)處理8周后，進行脫水處理，包埋于石蠟中。切片后番紅O染色，常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察、拍照。根據Mankin′s評分系統(tǒng)［12］，通過雙盲觀察在0～13的等級上進行評分分級。

1.7.3 免疫組織化學染色 取膝關節(jié)組織石蠟切片，烤片2 h，切片常規(guī)脫蠟至水后，分別加常規(guī)抗原修復液和骨組織抗原修復液進行抗原修復，然后用3%H2O2室溫孵育30 min，用10%山羊血清封閉30 min，滴加TBS稀釋的一抗Col2（1∶100），4 ℃孵育過夜，次日滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，DAB顯色，蘇木精復染，常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察、拍照。

1.7.4 女貞子提取物對大鼠原代軟骨細胞的影響 將細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板內，待細胞貼壁后進行給藥處理。分別加入不同質量濃度（0、5、10、15、25、50、100、200 μg/mL）女貞子提取物，于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h和48 h后進行MTT活性檢測。在避光環(huán)境中，向每個孔中加入10 μL MTT溶液（5.0 mg/mL）并在37℃孵育4 h。小心棄去孔內培養(yǎng)液，向每個孔中加入150 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，使紫色結晶物充分溶解。用酶標儀在490 nm處測量光密度值（OD），計算增殖率，增殖率（PR）=（女貞子處理的OD/未處理的OD）×100%。

1.7.5 Real-time PCR分析 將第2代大鼠原代軟骨細胞消化計數(shù)后，以5×105個/皿均勻接種于6 cm的細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后，隨機分為3組：對照組、TNF-α組、TNF-α+女貞子組。TNF-α組和TNF-α+女貞子組預先用TNF-α（10 ng/mL）處理6 h。TNF-α+女貞子組加入女貞子提取物（100 μg/mL），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。提取細胞核酸后使用Nano Drop超微量分光光度計測定RNA濃度。根據TAKARA逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，采用SYBR反應體系進行Real-time PCR反應，每個樣本設3個復孔，以Actin作內參，檢測各組MMP13、Col10、Col2、Aggrecan的表達水平，目標基因序列見表1，各基因mRNA表達用2-ΔΔCt計算結果來表示。

表1 目標基因引物序列

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠行為學觀察

見表2。模型組的壓痛閾值較正常組顯著下降（P＜0.01）；女貞子注射組與模型組比較有顯著提高（P＜0.01）；女貞子灌胃組與模型組比較有所提高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠壓痛閾值比較（g，±s）

表2 各組大鼠壓痛閾值比較（g，±s）

與模型組比較，?P＜0.01

正常組模型組女貞子灌胃組女貞子注射組8 8 8 8 266.60±26.99 255.00±41.01 240.50±16.39 255.30±19.69 279.13±19.29*108.88.±12.03 157.25±26.92 216.29±35.09*

2.2 各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織形態(tài)學觀察

見圖1。組織病理學結果顯示，模型組的Mankin′s評分為（4.39±1.42）分，高于空白組的（1.23±1.01）（P＜0.01）；女貞子注射組Mankin′s評分為（1.77±0.73）分，較模型組顯著下降（P＜0.01）；女貞子灌胃組（3.33±1.32）分，與模型組比較有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。女貞子注射組治療后明顯增加了軟骨表面的軟骨細胞數(shù)量，改善了軟骨細胞排列和膠原質量。

2.3 各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織Col2觀察

見圖2。模型組軟骨表達的Col2量少于正常組，女貞子灌胃和注射組的Col2表達趨于正常。

圖1 各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織病理學觀察（SO染色，比例尺=40 μm）

圖2 各大鼠軟骨中Col2表達的免疫組織化學觀察（200倍）

2.4 各組大鼠膝關節(jié)軟骨細胞活性比較

見表3。通過MTT法評估女貞子提取物對大鼠軟骨細胞的增殖作用。劑量范圍為5～200 μg/mL的女貞子提取物顯著增加了軟骨細胞的細胞活力，細胞增殖率在給藥24 h后從0.6%增加到53.1%，48 h后從40.5%增加到78.0%。

表3 各組大鼠膝關節(jié)軟骨細胞活性比較（%，±s）

表3 各組大鼠膝關節(jié)軟骨細胞活性比較（%，±s）

女貞子質量濃度5 μg/mL 10 μg/mL 15 μg/mL 25 μg/mL 50 μg/mL 100 μg/mL 200 μg/mL給藥后24 h 0.58±3.31 8.51±3.16 14.76±10.74 31.82±7.17 38.50±10.17 54.23±16.98 53.09±5.11給藥后48 h 40.50±15.55 54.93±14.37 61.55±14.70 67.06±9.60 75.74±8.03 81.64±15.50 78.03±10.08

2.5 各組軟骨細胞中OA相關基因表達水平比較

見表4。用TNF-α預處理軟骨細胞以模擬OA病理狀態(tài)。與正常組相比，TNF-α組顯著上調Col10、MMP13的表達，下調Col2和Aggrecan的表達（P＜0.05或P＜0.01）。在女貞子處理24 h后，與TNF-α組相比，這些基因的異常表達向正常水平逆轉（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 各組軟骨細胞中OA相關基因表達比較（±s）

表4 各組軟骨細胞中OA相關基因表達比較（±s）

與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與TNF-α組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別正常組TNF-α組TNF-α+女貞子組Col10 mRNA 1.01±0.17 1.39±0.03##1.22±0.05#*Col2 mRNA 1.00±0.02 0.79±0.03##1.07±0.05##**Aggrecan mRNA 1.00±0.02 0.70±0.02##0.80±0.07##**Mmp13 mRNA 1.00±0.02 2.33±0.21##0.82±0.05##**

3 討論

OA屬于中醫(yī)學“骨痹”范疇，本病發(fā)病多因肝血不足、腎元虧虛、血脈瘀滯，致骨失其所養(yǎng)，筋骨不堅，瘀血內阻或兼有外邪侵襲，經脈痹阻而致。中醫(yī)藥治療OA的原則是補腎活血、強筋健骨、舒筋活絡。臨床中的辨證分型主要集中在風寒濕阻、氣滯血瘀、痰瘀互結、痰濕阻絡和肝腎虧虛等證型，在治療上應采用補益肝腎、強腰健膝的中藥。女貞子性涼，味甘、苦，歸肝、腎經，具有滋補肝腎、明目烏發(fā)之功效，可用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發(fā)早白、目暗不明等癥?，F(xiàn)代藥理實驗表明，滋補腎陰中藥能提高血清雌二醇水平，而雌激素水平降低與骨性關節(jié)炎的發(fā)生顯著相關［10］。因此，女貞子具有被開發(fā)為抗骨關節(jié)炎藥物的潛力。

局部關節(jié)內注射治療是KOA保守治療的代表方法。由于KOA病變僅存在于關節(jié)中，因此通過關節(jié)內注射途徑施用的局部治療是合適的策略。1951年，Hollander及其同事首次在關節(jié)炎中引入關節(jié)內注射治療［13］，后來IA治療被美國食品藥品管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）批準。與常規(guī)口服給藥相比，該技術避免了全身暴露和潛在的不良副作用。實際上，關節(jié)內注射具有許多內在特征，這可能比系統(tǒng)療法更有優(yōu)勢：增加的生物利用度和安全性，更低的藥物劑量和全身毒性，可避免的常規(guī)聯(lián)合進入障礙和積極的安慰劑益處［14］。此外，它是一種相對簡單且耐受性良好的程序，其恢復時間最短，可用作口服生物利用度低的藥物的替代方式［15-16］。臨床試驗證明，IA療法是KOA患者的一種替代和安全的治療方法，與常規(guī)治療相比，患者因不良事件而退出治療的比例較低［17-18］。關節(jié)內注射是一種創(chuàng)新方式，可能有助于提高中醫(yī)療法的有效性和安全性。

研究發(fā)現(xiàn)關節(jié)腔注射云南白藥，能通過抑制滑膜組織中降鈣素基因相關肽（CGRP）陽性神經細胞的增生和巨噬細胞抗原（ED1）陽性炎癥細胞數(shù)量，對KOA疼痛和炎癥有明顯的治療作用［19］。研究發(fā)現(xiàn)通過膝關節(jié)關節(jié)腔注射鳳凰衣水解物降低膝骨關節(jié)炎大鼠的炎癥因子表達，提高關節(jié)軟骨中蛋白多糖和Collagen-Ⅱ含量，對改善關節(jié)液炎癥指標效果更好［20］。本實驗通過比較女貞子提取物灌胃和關節(jié)腔注射治療大鼠KOA，評估不同給藥方式對女貞子抗OA作用的影響。結果表明，女貞子關節(jié)腔注射能明顯減輕關節(jié)疼痛，而女貞子灌胃治療對OA大鼠減輕疼痛的效果不如女貞子注射組。同樣在大鼠軟骨組織病理Mankin′s評分中，女貞子灌胃組和女貞子注射組低于模型組，女貞子注射組治療效果優(yōu)于女貞子灌胃組，女貞子提取物關節(jié)腔注射有明顯的治療效果。關節(jié)腔注射女貞子提取物直入靶點，作用明確，效果顯著。

在本研究中，免疫組織化學分析顯示女貞子的潛在機制與軟骨中Col2表達的調節(jié)相關。以100 μg/mL的女貞子提取物進行體外實驗評估，RT-PCR測定進一步闡明了女貞子不僅逆轉了Mmp13、Col2和Col10的異常表達，還恢復了TNF-α處理的軟骨細胞中Aggrecan的表達。本實驗研究結果揭示了女貞子有抗OA作用，并闡明了與抑制軟骨細胞肥大和分解代謝相關的分子機制。

只有一種動物模型不足以完全明確女貞子的藥理學特征。因此，需要進一步的研究來驗證女貞子對其他OA模型的抗OA作用。本研究嘗試將關節(jié)內注射與中醫(yī)治療相結合，為補充傳統(tǒng)治療策略提供了另一種治療方案?？诜侵嗅t(yī)治療的傳統(tǒng)途徑。目前對關節(jié)內注射與口服之間差異的認識在中醫(yī)藥領域還很有限，需要更大規(guī)模的長期研究來獲得更積極的結果，進一步證實關節(jié)內注射中藥治療的適用性。本實驗通過RT-PCR分析評估女貞子對軟骨細胞的體外作用，闡明了其與TNF-α處理的軟骨細胞中Mmp13、Col2、Col10和Aggrecan的基因表達相關的機制，并未明確其具體信號通路，仍需要進一步的研究。