冷凍復(fù)蘇周期不同囊胚移植方案對(duì)不同年齡患者妊娠結(jié)局的影響

劉景 孔紅嬌 胡繼君 魏雅靜 周夢(mèng)鴿 王云霞 李娜

輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）最理想結(jié)局是獲得一個(gè)健康的子代。然而，傳統(tǒng)ART 通常通過(guò)增加胚胎移植數(shù)目來(lái)提高妊娠成功率，但同時(shí)伴隨的是多胎妊娠率的顯著增加。目前我國(guó)的多胎妊娠率已超過(guò)30%，有些生殖中心甚至高達(dá)40%以上［1］，是自然多胎妊娠的幾十倍。多胎妊娠是ART 治療后孕產(chǎn)婦最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。多胎妊娠所導(dǎo)致的妊娠期高血壓、早產(chǎn)和低出生體重兒等并發(fā)癥給患者的家庭和社會(huì)造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)［2］。因此為了有效降低多胎妊娠率，不少學(xué)者建議行單囊胚移植［3-4］。目前，關(guān)于單囊胚移植的研究大部分還只關(guān)注臨床妊娠率，活產(chǎn)率作為主要觀察指標(biāo)的研究較少。為探討既可以保證高妊娠率，又可以降低多胎妊娠率的最佳凍融囊胚移植方案，本研究對(duì)在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心首次行D5/D6 凍融囊胚移植周期的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行了回顧性分析，觀察其妊娠結(jié)局，旨在為臨床治療提供數(shù)據(jù)指導(dǎo)。

1 資料和方法

1.1 一般資料本研究回顧性分析2016年1月至2018年7月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心首次進(jìn)行D5/D6 囊胚凍融移植（freezing-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET）周期的（n= 2 582）患者病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：凍融囊胚移植；自體卵母細(xì)胞；子宮內(nèi)膜厚度≥7 mm。排除標(biāo)準(zhǔn)：反復(fù)移植失敗患者；患有基礎(chǔ)疾??；胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)（preimplantation genetic testing，PGT）周期；凍卵與供卵周期；子宮肌瘤或子宮內(nèi)膜異位癥；其他內(nèi)分泌疾??；內(nèi)膜病變；數(shù)據(jù)不全周期。

1.2 方法根據(jù)移植的囊胚數(shù)目及評(píng)分對(duì)女性患者年齡≤37歲組和＞37歲組分別分A、B、C、D、E 5 個(gè)亞組。分別為1 枚優(yōu)質(zhì)囊胚移植組（A 組）、1 枚非優(yōu)質(zhì)囊胚移植組（B 組）、2 枚優(yōu)質(zhì)囊胚移植組（C 組）、1 枚優(yōu)質(zhì)囊胚和1 枚非優(yōu)質(zhì)囊胚協(xié)同移植組（D 組）、2 枚非優(yōu)質(zhì)囊胚移植組（E 組），分別比較兩組中不同囊胚移植方案的妊娠結(jié)局。對(duì)主要觀察指標(biāo)活產(chǎn)率及多胎妊娠率，次要觀察指標(biāo)植入率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率進(jìn)行組間比較。

1.2.1 胚胎冷凍和解凍采用玻璃化冷凍復(fù)蘇試劑盒（Kitazato，日本）。試劑從冰箱內(nèi)取出后于室溫下平衡至少30 min。將囊胚移入平衡液（equilibrium solution，ES），10 min 后轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液（vitrification solution，VS）中平衡，于60 s 內(nèi)將囊胚放至已標(biāo)記的冷凍載體（Kitazato，日本）上，迅速投入液氮并裝入套管。解凍時(shí)，去除載體套管，將胚胎端迅速移至37 ℃解凍液（TS）中，使囊胚在TS 液中平衡1min，再將囊胚移入稀釋液（DS）和洗滌液1、2（WS1、WS2）中各3 min。最后將囊胚移入囊胚培養(yǎng)液（vitrolife，瑞典）中并置于37 ℃，含6% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)（平板培養(yǎng)箱，美國(guó)Cook 公司）等待移植。

1.2.2 囊胚評(píng)分及分組本中心采用Gardner 評(píng)分系統(tǒng)，根據(jù)囊腔擴(kuò)張程度和是否孵化，將囊胚分為6 個(gè)時(shí)期。1 期：囊胚腔體積小于胚胎總體積的50%；2 期：囊胚腔體積大于或等于胚胎總體積的50%；3 期：囊胚腔完全占據(jù)胚胎的總體積；4 期：擴(kuò)張囊胚，囊胚腔完全占滿(mǎn)胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變??；5 期：正在孵出的囊胚，囊胚的一部分從透明帶中逸出；6 期：完全孵出囊胚。將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層細(xì)胞分為A-C 級(jí)。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)分，A：細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密；B：細(xì)胞數(shù)目少，排列松散；C：細(xì)胞數(shù)目很少。滋養(yǎng)層細(xì)胞評(píng)分，A：上皮細(xì)胞層有較多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)致密；B：上皮細(xì)胞層有不多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)松散；C：上皮細(xì)胞層有稀疏的細(xì)胞組成。根據(jù)囊胚的發(fā)育階段以及內(nèi)細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞的形態(tài)對(duì)囊胚進(jìn)行分級(jí)，優(yōu)質(zhì)囊胚定義為≥4BB（AA、AB、BA、BB）。因本中心僅冷凍內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)分為A 或B 的囊胚用于移植，所有非優(yōu)質(zhì)囊胚定義為＜4BB（AC、BC）。

1.2.3 臨床結(jié)局的判定及計(jì)算移植后14 d 抽血查驗(yàn)HCG，陽(yáng)性者于29 d 后行B 超檢查，測(cè)到孕囊者為臨床妊娠；將妊娠未達(dá)28 周、胎兒體重不足1 000 g 而終止妊娠者稱(chēng)為流產(chǎn)；妊娠滿(mǎn)28 周并分娩的活產(chǎn)嬰兒稱(chēng)為活產(chǎn)；一次妊娠宮腔內(nèi)同時(shí)有兩個(gè)或兩個(gè)以上胎兒時(shí)稱(chēng)為多胎妊娠。著床率=孕囊數(shù)/總移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期患者數(shù)× 100%；多胎妊娠率=多胎妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率= 活產(chǎn)的分娩周期數(shù)/移植周期患者數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)（早期流產(chǎn)數(shù)+晚期流產(chǎn)數(shù)）/移植周期數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（ANOVA）；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 年齡≤37 歲的5 組患者基本資料及妊娠結(jié)局比較

2.1.1 基本資料5 組共納入2 227 個(gè)周期，A 組590 個(gè)周期，B 組700 個(gè)周期，C 組206 個(gè)周期，D 組265 個(gè)周期，E 組466 個(gè)周期。5 組患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、子宮內(nèi)膜厚度、FSH 和LH 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.1.2 年齡≤37 歲妊娠患者不同囊胚移植策略結(jié)局的比較與A 組相比，B 組和E 組植入率降低、C組增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D組植入率增加（P＞0.05）。與A組比較，B組臨床妊娠率顯著降低（P＜0.05）；而C、D、E 組臨床妊娠率顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。E組流產(chǎn)率增加，B、C 和D 組降低，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與A 組比較，B 組活產(chǎn)率顯著降低（P＜0.05）；而C、D、E 組活產(chǎn)率顯著增加（P＜0.01）。B 組多胎妊娠率增加，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；而C、D、E 組多胎妊娠率顯著增加（P＜0.01），見(jiàn)表2和圖1。

表1 年齡≤37 歲5 組患者的一般資料Tab.1 General information of 5 groups of patients in patients ≤37 years old ±s

表1 年齡≤37 歲5 組患者的一般資料Tab.1 General information of 5 groups of patients in patients ≤37 years old ±s

組別A 組B 組C 組D 組E 組F 值P 值年齡（歲）29.43±3.10 29.76±3.11 29.56±3.31 29.55±3.17 29.23±3.26 1.019 0.359 BMI（kg/m2）23.10±3.34 23.24±3.11 22.90±3.09 22.68±3.20 23.33±3.27 2.204 0.089內(nèi)膜厚度（mm）9.26±1.57 9.24±1.57 9.19±1.46 9.32±1.56 9.28±1.47 0.238 0.917 FSH（IU/L）6.25±1.95 6.43±2.25 6.14±2.00 6.20±1.92 6.21±1.82 1.456 0.102 LH（IU/L）5.45±3.57 5.25±3.87 6.02±5.15 5.30±4.16 5.12±3.06 2.069 0.082

表2 年齡≤37 歲患者不同囊胚移植策略妊娠結(jié)局的比較Tab.2 Comparison of pregnancy outcomes in different blastocyst transfer strategies in patients ≤37 years old

2.2 年齡＞37 歲的5 組患者基本資料及妊娠結(jié)局比較

2.2.1 基本資料5 組共納入355 個(gè)周期，A 組84個(gè)周期，B 組163 個(gè)周期，C 組13 個(gè)周期，D 組31 個(gè)周期，E5 組64 個(gè)周期。5 組患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、子宮內(nèi)膜厚度、FSH 和LH 比較組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。

2.2.2 年齡＞37 歲妊娠患者不同囊胚移植策略結(jié)局的比較與A 組相比，B 組和E 組植入率降低、C組和D 組增加，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與A 組比較，B 組臨床妊娠率降低、C 組和E 組增加，差異均無(wú)顯著性（P＞0.05）；D 組臨床妊娠率增加（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。D 組流產(chǎn)率增加，B 組、C 組和E 組降低，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與A 組比較，B 組活產(chǎn)率降低、D 組和E 組增加，差異均無(wú)顯著性（P＞0.05）；而C 組活產(chǎn)率增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B組多胎妊娠率降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；D 組顯著增加（P＜0.05）；C 組和E 組顯著增加（P＜0.01）。見(jiàn)表4和圖2。

圖1 年齡≤37 歲妊娠患者不同囊胚移植策略結(jié)局的比較Fig.1 Comparison of pregnancy outcomes in different blastocyst transfer strategies in patients ≤37 years old

表3 年齡＞37 歲5 組患者的一般資料Tab.3 General information of 5 groups of patients in patients ＞37 years old ±s

表3 年齡＞37 歲5 組患者的一般資料Tab.3 General information of 5 groups of patients in patients ＞37 years old ±s

組別A 組B 組C 組D 組E 組F 值P 值年齡（歲）39.93±2.14 40.72±2.32 40.77±2.31 40.58±2.42 40.52±2.35 1.721 0.145 BMI（kg/m2）23.72±2.95 24.21±2.84 24.24±2.79 24.02±3.39 25.97±18.37 0.765 0.549內(nèi)膜厚度（mm）9.07±1.88 9.34±1.59 9.56±1.30 9.17±1.69 9.52±2.00 0.761 0.551 FSH（IU/L）6.63±1.61 7.10±1.61 6.89±1.32 6.68±1.51 6.66±1.48 1.775 0.133 LH（IU/L）4.29±2.41 4.19±2.53 3.51±1.96 3.84±1.35 4.70±2.58 1.111 0.351

表4 年齡＞37 歲患者不同囊胚移植策略妊娠結(jié)局的比較Tab.4 Comparison of pregnancy outcomes in different blastocyst transfer strategies in patients ＞37 years old

圖2 ＞37 歲患者不同囊胚移植策略妊娠結(jié)局的比較Fig.2 Comparison of pregnancy outcomes in different blastocyst transfer strategies in patients ＞37 years old

3 討論

許多生殖中心針對(duì)年輕患者，為有效降低多胎妊娠風(fēng)險(xiǎn)，更傾向于單囊胚移植［5-6］。近年來(lái)大量研究結(jié)果支持這一觀點(diǎn)，HARBOTTLES 等［7］研究結(jié)果表明，單囊胚移植能顯著降低多胎妊娠率，同時(shí)減少早產(chǎn)和低出生體質(zhì)量?jī)罕壤?。因此單囊胚移植逐漸被認(rèn)為是一種降低多胎妊娠率較為理想的移植策略。但是對(duì)于不同人群、不同囊胚質(zhì)量，凍融囊胚移植策略的選擇仍存在爭(zhēng)議。

美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)會(huì)推薦，年齡＜35 歲的女性患者實(shí)施選擇性單囊胚移植；英國(guó)衛(wèi)生保健分會(huì)（NICE）建議＜39歲的患者前兩個(gè)周期有≥1枚優(yōu)質(zhì)胚胎的行單胚胎移植；MANCUSO 等［8］建議＜38 歲的患者行單囊胚移植。且大量研究［9］表明，單胚胎移植周期不僅減少了多胎妊娠的發(fā)生率及相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，且兩個(gè)周期的累計(jì)妊娠率及持續(xù)活產(chǎn)率可達(dá)到一個(gè)周期移植兩枚胚胎相同的效果。本中心的既往數(shù)據(jù)顯示37 歲是影響活產(chǎn)率的年齡拐點(diǎn)（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。張玉婷等［10］研究結(jié)果也支持這個(gè)觀點(diǎn)，38 ～40 歲及41 ～43 歲患者活產(chǎn)率與35 ～37 歲相比呈斷崖式下降，分別為21.5%，8.1%及32.5%?；町a(chǎn)率是本研究的主要觀察指標(biāo)，因此，我們以37 歲為界限來(lái)分析不同組別的各個(gè)臨床治療結(jié)局。本研究結(jié)果顯示，年齡≤37 歲患者，單優(yōu)質(zhì)囊胚組雖然臨床妊娠率低于移植雙優(yōu)質(zhì)囊胚組，但仍可達(dá)到50%以上，而多胎妊娠率下降到2.0%；相反，移植雙優(yōu)質(zhì)囊胚組雖然臨床妊娠率和活產(chǎn)率分別可達(dá)到84.0%和75.7%，但多胎妊娠胎率達(dá)57.2%。此結(jié)果與先前發(fā)表文獻(xiàn)結(jié)果［11］一致。多胎妊娠可導(dǎo)致妊娠期高血壓等嚴(yán)重并發(fā)癥，考慮到母嬰風(fēng)險(xiǎn)增高。因此，當(dāng)有優(yōu)質(zhì)囊胚可移植時(shí)，進(jìn)行單囊胚移植將會(huì)是最佳的移植方案。

自二孩政策開(kāi)放以來(lái)，高齡不孕患者逐漸增多，而生育力低下問(wèn)題備受關(guān)注。隨著年齡增長(zhǎng)，卵巢功能減退導(dǎo)致卵母細(xì)胞數(shù)目和質(zhì)量下降［12］，進(jìn)而導(dǎo)致妊娠率降低。目前，高齡患者妊娠結(jié)局仍不理想，且面臨巨大的倫理挑戰(zhàn)［13］，對(duì)于高齡患者凍融周期囊胚移植策略仍在探索中。劉杰等［14］認(rèn)為＞37 歲患者應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況及胚胎質(zhì)量綜合決定移植策略；而呂興鈺等［15］認(rèn)為＞38 歲患者可行雙囊胚移植。本研究結(jié)果顯示，年齡＞37 歲的患者，雖然雙優(yōu)質(zhì)囊胚移植后活產(chǎn)率增加，但同時(shí)，多胎妊娠率也顯著增加。因此，對(duì)于高齡患者，具有2 枚及以上優(yōu)質(zhì)囊胚可移植時(shí)，筆者建議單囊胚移植。僅有≤1 枚優(yōu)質(zhì)囊胚時(shí)，建議在詳盡告知雙胎妊娠存在的風(fēng)險(xiǎn)后，患者仍強(qiáng)烈要求移植兩枚囊胚的情況下，可以在成熟的減胎技術(shù)支持下進(jìn)行雙囊胚的移植，并告知如雙胎妊娠建議減胎。

與優(yōu)質(zhì)囊胚相比，非優(yōu)質(zhì)囊胚的發(fā)育潛能降低，對(duì)其移植策略仍存在爭(zhēng)議。WINTNER 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，1 枚優(yōu)質(zhì)和1 枚非優(yōu)質(zhì)囊胚協(xié)同移植時(shí)非優(yōu)質(zhì)囊胚不會(huì)對(duì)優(yōu)質(zhì)囊胚的植入產(chǎn)生不利影響。而EL-DANASOURI 等［17］卻研究發(fā)現(xiàn)，非優(yōu)質(zhì)胚胎可能對(duì)優(yōu)質(zhì)胚胎的植入產(chǎn)生不利影響。非優(yōu)質(zhì)囊胚與優(yōu)質(zhì)囊胚協(xié)同移植后，前者對(duì)后者是否有不良影響仍存爭(zhēng)議。本研究結(jié)果表明，年齡≤37 歲患者，移植1 枚優(yōu)質(zhì)協(xié)同1 枚非優(yōu)質(zhì)雙囊胚的臨床妊娠率和活產(chǎn)率顯著高于移植單優(yōu)質(zhì)囊胚，提示非優(yōu)質(zhì)囊胚并未對(duì)優(yōu)質(zhì)囊胚產(chǎn)生不利影響。但由于多胎妊娠率明顯增高（2.0%vs.55.7%，P=0.000），筆者仍不建議進(jìn)行雙囊胚移植。年齡＞37 歲的患者，移植1 枚優(yōu)質(zhì)協(xié)同1 枚非優(yōu)質(zhì)雙囊胚組的活產(chǎn)率未明顯高于單優(yōu)質(zhì)囊胚組，但多胎妊娠率增加（7.8%vs.38.1%，P= 0.011），建議單囊胚移植。本研究結(jié)果也顯示，無(wú)論年齡≤37 歲或＞37 歲患者，移植2 枚非優(yōu)質(zhì)囊胚組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率均高于移植單優(yōu)質(zhì)囊胚組，同時(shí)，多胎妊娠率也顯著增加，尤其對(duì)于年齡≤37 歲患者（2.0%vs.45.1%）。分析其原因，筆者認(rèn)為本研究結(jié)果在一定程度上可能受到胚胎分級(jí)方法的影響，即胚胎的形態(tài)學(xué)評(píng)估存在主觀性。我們發(fā)現(xiàn)，無(wú)論≤37 歲或＞37 歲患者，與單囊胚移植周期相比，無(wú)論移植囊胚的質(zhì)量如何，雙囊胚移植都顯著增加了多胎妊娠率。一些研究［18］表明，雖然向患者解釋兩個(gè)周期的選擇性單囊胚移植可以獲得與雙囊胚移植一個(gè)周期相似的活產(chǎn)率，但對(duì)于一些女性（特別是高齡女性）患者而言，與雙囊胚移植妊娠率增加相比，多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)是可以接受的。而VAN HEESCH 等［19］和SCOTLAND 等［20］研究表明多胎妊娠遠(yuǎn)期情況不太理想。因此綜合考慮妊娠結(jié)局和多胎妊娠給母兒帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)患者有優(yōu)質(zhì)囊胚時(shí)，仍建議單囊胚移植。

綜上所述，無(wú)論≤37 歲或＞37 歲患者，當(dāng)患者有≥2 優(yōu)質(zhì)囊胚可用于移植時(shí)，我們建議單囊胚移植。僅有≤1 枚優(yōu)質(zhì)囊胚時(shí)，對(duì)于≤37 歲患者，不建議行雙囊胚移植；對(duì)于＞37 歲患者，建議單囊胚移植，或特殊情況下在成熟的減胎技術(shù)支持下進(jìn)行雙囊胚的移植。